脑缺血及后适应对树鼩海马内质网应激信号分子PERK及GRP78的影响*

陈理军，马　艳，李　霞，陈　静，李树清，张　颖△(昆明医科大学病理生理学教研室，云南昆明　65003;红河卫生职业学院，云南蒙自6600)



脑缺血及后适应对树鼩海马内质网应激信号分子PERK及GRP78的影响*

陈理军1，马艳2，李霞1，陈静1，李树清1，张颖1△
(1昆明医科大学病理生理学教研室，云南昆明650031;2红河卫生职业学院，云南蒙自661100)

［摘要］目的:探讨脑缺血及后适应对树鼩海马内质网应激信号分子蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)及葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的影响及后适应的脑保护机制。方法:光化学反应诱导树鼩局部血栓性脑缺血，于脑缺血后3.5 h夹闭、打开缺血侧颈总动脉交替3个循环(每次5 min)以复制缺血后适应模型。HE染色观察缺血侧海马神经元损伤及超微结构变化，RT-PCR检测脑缺血及后适应不同时间海马组织PERK及GRP78 mRNA表达的变化，免疫组织化学法与Western blot法检测PERK及GRP78的蛋白定位及表达变化。结果:海马神经元随脑缺血时间延长而损伤加重，缺血24 h损伤最为严重，后适应可减轻损伤。脑缺血4 h、24 h及72 h PERK的mRNA及蛋白表达较假手术组增高(P＜0.05)，后适应组与相应的缺血组相比，PERK的mRNA及蛋白表达减少，4 h、24 h差异显著(P＜0.05) ;脑缺血4 h、24 h及72 h GRP78的mRNA及蛋白表达与假手术组无明显差异，后适应24 h组较缺血24 h组表达增高(P＜0.05)。结论:树鼩局部血栓性脑缺血可激活缺血侧海马内质网应激反应，引起PERK/eIF2α信号转导通路中相关分子PERK的mRNA及蛋白表达增高。缺血后适应处理通过下调PERK、上调GRP78的表达，减轻内质网应激反应，减少神经元损伤，具有一定的脑保护作用。

［关键词］蛋白激酶R样内质网激酶;葡萄糖调节蛋白78;缺血后适应;内质网应激;海马;光化学反应;树鼩

［修回日期］2015-04-16

Effects of cerebral ischemia and postconditioning on signaling molecules PERK and GRP78 in hippocampus tissue of tree shrew during endoplasmic reticulum stress

CHEN Li-jun1，MA Yan2，LI Xia1，CHEN Jing1，LI Shu-qing1，ZHANG Ying1
(1Department of Pathophysiology，Kunming Medical University，Kunming 650031，China;2Honghe Vocational Health College，Mengzi 661100，China.E-mail: coco90305@126.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effects of cerebral ischemia and postconditioning on protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) and glucose-regulated protein 78 (GRP78) in the hippocampus tissue of tree shrew during endoplasmic reticulum stress and the mechanism of post-conditioning protecting the brain from damage.METHODS: The focal cerebral ischemic model was duplicated by photochemical reaction in tree shrew and the postconditioning was induced by alternatively occluding and opening the carotid artery of ischemic side for 3 cycles (5 min each cycle) at 3.5 h after ischemia.The damage and ultrastructural changes of the hippocampal neurons were observed by HE staining.The expression of PERK and GRP78 at mRNA and protein levels in the hippocampal tissue at different time points after cerebral ischemia and postconditioning was determined by RT-PCR，immunohistochemistry and Western blot.RESULTS: The injuries of hippocampal neurons were aggravated with prolonged cerebral ischemia，which was most severe at 24 h after ischemia while the postconditioning alleviated these damages correspondingly.The expression of PERK at mRNA and protein levels was upregulated at 4 h，24 h and 72 h after ischemia (P＜0.05)，while postconditioning downregulated the expressions of PERK at ischemia and postconditioning 4 h (IP4 h) gruop and IP24 h group (P＜0.05).The expression of GRP78 at mRNA and protein levels was not changed at 4 h，24 h and 72 h after ischemia，while postconditioning upregu-lated the expressions of GRP78 at IP24 h group (P＜0.05).CONCLUSION: The focal thrombotic cerebral ischemia activates the endoplasmic reticulum stress in ischemic hippocampus of tree shrews，leading to the changes in mRNA and protein expression of PERK in the PERK/eIF2α signal transduction pathway.The postconditioning treatment alleviates endoplasmic reticulum stress and neuronal damages by downregulating PERK and upregulating GRP78，thereby protecting the brain from injury.

［KEY WORDS］Protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase; Glucose-regulated protein 78; Ischemic postconditioning; Endoplasmic reticulum stress; Hippocampus; Photochemical reaction; Tree shrew

近年来有关内质网研究表明内质网不仅维持细胞的生存，而且参与了细胞凋亡的调控。缺血性脑损伤可诱导内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)［1］，适度而短暂的ERS对细胞具有保护作用，严重而长时间的ERS将导致细胞损伤。有研究报道［1］大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠，随着缺血时程延长，皮层热休克蛋70(heat shock protein 70，HSP70)及激活转录因子4(activating transcription factor 4，ATF-4)等ERS标志蛋白表达增多，而使用真核翻译起始因子2α (eucaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)特异拮抗剂后，上述蛋白及mRNA的表达相应减少，表明脑缺血可激活ERS的蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)/eIF2α通路。另有研究［2］发现大鼠经中脑动脉闭塞缺血再灌后脑梗塞面积增大，ERS的标志蛋白葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)及CHOP表达增加，且凋亡因子caspase-12平行出现在TUNEL染色阳性细胞中，证实脑缺血激活ERS所致的脑损伤可能与凋亡有关。我室前期研究也发现树鼩脑缺血可致内质网应激及内质网扩张，加重神经元损伤，但具体的发生机制尚不清楚。

由此可见，脑缺血再灌注引起的ERS可加重神经元继发性损伤，如何有效阻断ERS，而起到一定的脑保护作用?脑缺血后适应(postconditioning，Post-C)是指在脑缺血再灌注后一定时间内，给予数次短暂性缺血-再灌注，激活组织内源性保护机制，增强脑组织缺血耐受性，减少神经元继发性损伤［3］。Post-C是否可通过干预内质网应激，阻断内质网应激时信号转导通路，而起到相应的脑保护作用?基于此假设，本研究通过观察脑缺血及后适应对海马内质网应激关键的信号分子PERK及GRP78表达的影响，部分阐释脑缺血激活的内质网应激引起的脑损伤及Post-C干预ERS所起到的脑保护作用的机制。

材料和方法

1材料

1.1动物健康成年树鼩126只，雌雄不限，体重(100±20) g，由昆明医科大学实验动物中心提供，实验前避光、清洁、安静环境下单笼饲养，将动物随机分为假手术(sham)组、缺血(ischemic，I) 4 h(I4 h)组、缺血后适应4 h(IP4 h)组、缺血24 h(I24 h)组、缺血后适应24 h(IP24 h)组、缺血72 h(I72 h)组、缺血后适应72 h(IP72 h)组，共计7个组。实验动物术前及术后自由摄食摄水。

1.2仪器本室自行研制的SQ-Ⅲ型局部脑血栓形成装置，大体由光源(含滤波电路及触发器)、万能支架、数控光源及散热装置组成。光学系统组成包括干涉滤片及聚光透镜。光源中心波长(λ=560 nm)，带宽(Δλ=60 nm)，光强度(1×104W/m2)，用时间继电器控制照射时间。

1.3主要试剂硫喷妥钠为上海新亚药业有限公司产品;山羊血清封闭液购自北京博奥森生物技术有限公司; DAB显色试剂盒、Ⅱ抗Max-VisionTM即用型试剂购自福州迈新生物技术开发有限公司;Ⅰ抗PERK、GRP78购自Santa Cruz;β-actin购自Abcam; HRP标记羊抗兔、羊抗鼠Ⅱ抗购自KPL; PERK、GRP78、β-actin引物由生工生物工程股份有限公司合成; cDNA Synthesis Kit、PCR Master Mix购自Thermo。

2主要方法

2.1使用脑血栓形成装置建立树鼩局部血栓性脑缺血模型［4］以1%硫喷妥钠(5 mL/kg)腹腔注射麻醉动物，待动物麻醉将其固定，经舌下静脉一次性注射(1.5 g/L)孟加拉红生理盐水溶液(1.33 mL/kg)，待循环10 min后，用碘伏、75%的乙醇依次消毒右侧头部皮肤，于右侧头顶部备皮，自右耳屏前至右眼外眦作切口，分离部分颞肌以暴露顶区颅骨，将动物置于SQ-Ⅲ型局部脑血栓形成装置下，使光束聚焦直射颅骨表面，在光强度为1×104W/m2下照射血管15 min(时间由继电器控制)，照射期间维持颅骨表面温度于(36±1)℃。常规消毒并逐层缝合切口，放入饲养笼，保持体温。

2.2缺血后适应模型的建立在光化学法局部血栓性脑缺血模型复制成功后，在缺血4 h的时间点前40 min，用1%硫喷妥钠(2.5 mL/kg)麻醉动物，动物仰卧固定后，常规消毒颈部，作纵形正中切，切开皮肤、皮下组织及颈阔肌，在右侧胸锁乳突肌的前缘分离出颈动脉鞘，并确保迷走神经和颈内静脉得到保护，分离颈总动脉，穿线，在缺血4 h时点前30 min用无创动脉夹在甲状软骨平面夹闭颈总动脉5 min后，去掉动脉夹再灌注5 min，夹闭-开夹共计重复3个循环，用时30 min以复制缺血后适应模型。术后缝合动物颈部创口，放入饲养笼，保持体温。

2.3 HE染色样品从冰箱取出平衡至室温，蜡块标本连续切片，切片厚约4 μm，贴片，并移至55℃恒温箱内烤片4～6 h，切片在二甲苯中室温脱蜡10 min，移入二甲苯和纯乙醇(1∶1)混合液中5 min，入梯度下行乙醇，后经蒸馏水水化并转入染液，苏木精染液染色10 min，冲洗多余的染液，1%盐酸乙醇(70%乙醇配制)分化数秒(镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止)，冲洗20 min，或在碳酸锂饱和溶液中短时间碱化使细胞核呈蓝色，蒸馏水漂洗5 min(换2次水)，0.5%伊红染液染色1～5 min，梯度上行乙醇脱水(2次)，因为在95%以下的乙醇中伊红易脱色，所以采用二甲苯透明(2次)，共约10 min。封片:擦去切片周围多余的二甲苯，待二甲苯未干之前，迅速滴加适量中性树胶，加盖玻片封片。

2.4免疫组织化学法检测PERK、GRP78冰箱内取出蜡块标本平衡至室温，蜡块标本连续切片，切片厚度4 μm，并移至55℃恒温烤箱内烤片4～6 h，待切片周围的石蜡溶化，且保持湿润状态时即可停止烤片;组织切片脱蜡，置于二甲苯中室温孵育3次，每次10 min，将切片置于100%乙醇溶液内洗片2次，每次10 min，再将切片置于梯度下行乙醇溶液内洗片1次，每次5 min;最后将切片移入去离子水内5 min再水化;将切片置于1 mmol/L EDTA(pH 8.0)内煮沸15 min，进行抗原修复，自然冷却至40℃后用去离子水洗片3次，每次5 min，之后用含Triton X-100的PBS(PBS-TX)洗片3次，每次10 min，3% H2O2+ PBS(pH 7.4)溶液孵育去除内源性过氧化物酶;切片用0.05 mol/L PBS-TX缓冲液(pH 7.4)洗3次，每次10 min;然后用5%的山羊血清封闭60 min，甩去血清后直接加入GRP78、PERK(1∶100) I抗4℃下孵育过夜;第2天用PBS洗3次，每次10 min;加入II抗(鼠/兔)，室温下孵育30 min;用PBS洗3次，每次10 min;除去PBS液，加入新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3～5 min;自来水冲洗，苏木素复染，用0.1% HCl分化，自来水冲洗至返蓝;切片经梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。对照组以PBS代替Ⅰ抗进行孵育，其余步骤一致。染色结果在光学显微镜下进行观察，制作好的切片干燥避光储存。

2.5 RT-PCR检测PERK和GRP78的mRNA表达于对照组、脑缺血后不同时点、缺血后适应后不同时点麻醉动物，迅速断头经高压蒸汽灭菌处理取缺血侧海马，按TRIzol试剂说明书提取总RNA，测定RNA样品的纯度和含量，逆转录反应合成cDNA，以cDNA为模版，按25 μL的体系进行RT-PCR(各基因扩增的退火温度如下: PERK 42.5℃; GRP78 47.5 ℃;β-actin 52.5℃)，琼脂糖凝胶电泳，电泳后取出凝胶，在紫外线下观察，可见桔黄色条带，用凝胶电泳成像仪系统采集图像。引物见表1。

表1　 PERK、GRP78与β-actin的引物序列Table 1.Primer sequences of PERK and GRP78

2.6 Western blot检测PERK和GRP78的蛋白水平

于对照组、脑缺血后不同时点、缺血后适应后不同时点麻醉动物，迅速断头在冰面上经消毒取缺血侧海马，按组织重量每100 mg组织加入1 mL裂解液提取总蛋白，Bradford法测定蛋白质浓度，进行SDSPAGE，电泳后半干转到PVDF膜，用保鲜膜将PVDF膜封起来，5%脱脂牛奶封闭，室温振摇封闭2 h，将PERK、GRP78抗兔多克隆抗体(1∶800)和β-actin抗鼠多克隆抗体(1∶20 000)用含0.1% Tween-20 TBS封闭液稀释后分别加入，室温振摇2 h后，4℃冰箱中孵育过夜，用含0.05% Tween-20的TBST洗膜3次，依次为30 min、20 min、10 min，将辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗用含0.1% Tween-20 TBS封闭液稀释后分别加入，室温振摇2 h，用含0.05% Tween-20的TBS洗膜3次，依次为30 min、20 min、10 min。ECL化学发光处理6 min后(PERK、GRP78)或1 min后(β-actin)，采用化学发光凝胶成像仪检测目的条带。

3统计学处理

实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，用GraphPad Prism 5统计软件行方差齐性检验、单因素方差分析，样本均数间的两两比较用q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 HE染色结果

假手术组海马结构完整、层次清晰、分布均匀，海马神经元细胞的形态结构未出现异常，CA1区的锥体细胞形态正常，细胞核大而且呈圆形，核仁较明显。缺血4 h组可见缺血性改变;随缺血时间延长，海马神经元细胞损伤加重，缺血24 h组的病变最为明显，此时缺血侧海马CA1区锥体细胞的胞体缩小，胞浆尼氏小体消失，呈嗜酸性变，细胞核固缩，核仁消失，结构紊乱，细胞周围形成空泡，神经元密度急剧减少。缺血72 h组海马病变有所减缓，但仍有部分神经元细胞固缩。后适应4 h组可见神经元嗜酸性变有所减轻，而后适应24 h组海马神经元损伤有明显的减轻，后适应72 h组神经元细胞出现层次性增加，见图1。

Figure 1.The HE staining and expressions of PERK and GRP78 in by immunohistochemistry the hippocampus of tree shrew during cerebral ischemia and post-conditioning.图1脑缺血及后适应缺血侧海马组织HE染色及PERK与GRP78免疫组化结果

2免疫组织化学染色结果

光学显微镜下观察，阳性反应部位呈现棕黄色(DAB显色)。假手术组海马PERK蛋白散在而且低水平表达，I4 h、I24 h及I72 h组缺血侧海马PERK的表达增强，以I4 h最为明显。后适应与相应缺血组对比，PERK蛋白表达减少，IP24 h组减少最为显著;假手术组海马GRP78蛋白散在而且低水平表达，I4 h、I24 h及I72 h树鼩海马GRP78的表达略增强。后适应组与缺血组相比，IP24 h组表达增强，见图1。

3脑缺血及后适应对缺血侧海马组织PERK、GRP78 mRNA表达的影响

局部血栓性脑缺血I4 h组、I24 h组及I72 h组缺血侧海马组织PERK的mRNA表达较假手术组明显增强(P＜0.05)。后适应组与缺血组比较，IP4 h组、IP24 h组海马组织PERK的mRNA表达减少(P＜0.05) ;局部血栓性脑缺血I4 h组I24及I72 h组缺血侧海马组织GRP78的mRNA表达较假手术组稍高，但差异不显著。后适应组与缺血组比较，IP24 h组海马的GRP78 mRNA表达增强(P＜0.05)，见图2。

4脑缺血及后适应对缺血侧海马组织PERK、GRP78蛋白表达的影响

局部血栓性脑缺血I4 h组、I24 h组及I72 h组缺血侧海马组织PERK蛋白表达较假手术组明显增强(P＜0.05)。后适应组与缺血组比较，IP24 h组及IP72 h组海马PERK蛋白表达减少(P＜0.05) ;局部血栓性脑缺血I4 h组、海马GRP78蛋白表达较假手术组增强(P＜0.05)。后适应组与缺血组比较，IP24 h组海马GRP78蛋白表达增强(P＜0.05)，见图2。

Figure 2.The expression of PERK and GRP78 at mRNA and protein levels in ischemic hippocampus of tree shrew during cerebral ischemia and postconditioning.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs I4 h;△P＜0.05 vs I24 h.图2脑缺血及后适应缺血侧海马组织PERK与GRP78 mRNA和蛋白的表达

讨论

大量研究表明缺血再灌可加重脑组织的损伤及功能障碍，本实验主要探讨光化学诱导树鼩局灶性脑缺血是否激活海马内质网应激PERK/eIF2α信号转导通路及后适应的干预机制。研究发现随缺血时间延长，缺血侧海马神经元损伤加重，神经元密度急剧减少，缺血72 h组海马病变有所减缓，但仍有部分神经元细胞固缩，而同时内质网表现出结构紊乱，内质网池扩张及溶解。这与汤諹等［4］研究一致，表明脑缺血可激活内质网应激，并损伤神经元。

PERK属于内质网应激PERK/elF2α信号转导通路的启动蛋白，通过胞浆内结构域的自身二聚化和磷酸化而激活［5］。有研究发现使用PERK选择性抑制剂U0126可以加重神经元的死亡，从而推测PERK在内质网应激在缺血性脑损伤中起保护作用［6］。然而近年来的研究更倾向于PERK可加重缺血性脑损伤的观点，Henriksson等［7］证明U0126抑制PERK激活后可减轻神经元损伤。本研究亦发现，脑缺血后海马组织PERK表达增强，神经元损伤加重，可能与PERK通路持续性激活引起严重的ERS、启动CHOP诱发凋亡、促使缺血/再灌注损伤加重有关。

GRP78是HSP70家族成员之一，也是一种分子伴侣，在ERS时表达上调，促进新合成的多肽进一步折叠、修饰或与堆积的未折叠蛋白及错误折叠的蛋白相结合后通过内质网相关降解反应来实现对未折叠蛋白或错误折叠蛋白降解［8］，在应激状态下具有维护内质网正常功能及维持细胞内Ca2+平衡的作用［9］。研究表明GRP78作为PERK/eIF2α信号转导通路的上游相关分子，可抑制脑缺血诱导的内质网应激产生的损伤［10］。本研究发现，脑缺血损伤诱导内质网应激引起GRP78表达升高，可能与GRP78需要去应对缺血引起的内质网应激时大量未折叠或错误折叠蛋白质减少内质网损伤有关，表明GRP78具有一定的神经保护作用。

减轻缺血后神经元损伤一直是国内外脑缺血基础研究和探索的重要领域。Post-C是一种在方法上与缺血预适应完全不同，但作用相似的脑保护措施。海马神经元是脑缺血或其它毒性物质最易损伤区域［11］，我室前期研究亦发现多次短暂闭塞动物的颈动脉可延长树鼩脑缺血治疗的“时间窗”，缺血后适应可显著提高缺血24 h、72 h海马CA1区局部区域血流［12］。本次研究发现，缺血后适应下调PERK、上调GRP78而减轻内质网应激，从而减轻缺血侧海马神经元的损伤。本研究还发现，脑缺血4 h时PERK表达即有改变，4 h是脑缺血病理生理过程的超早期，从形态学角度虽未观察到神经元改变，而相关信号转导通路已被激活［2］。如果能在此期间通过缺血后适应处理，激活自身组织细胞内源性保护作用机制，可增强脑组织缺血耐受性，从而减轻继发性脑损伤。

综上所述，脑缺血可诱发内质网应激反应，PERK/eIF2α信号转导通路得以激活，其中的信号分子PERK与GRP78表达发生改变，从而加重神经元继发性损伤。而缺血后适应可下调PERK、上调GRP78而减轻内质网应激反应，从而起到一定的脑保护作用。

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通讯作者△Tel: 0871-65922858; E-mail: coco90305@126.com

*［基金项目］国家科技支撑计划(No.2014BAIO1B01) ;国家自然科学基金资助项目(No.31360245) ;云南省应用基础研究(昆医联合专项) (No.2012FB013)

［收稿日期］2014-11-05

［文章编号］1000-4718(2015)06-1105-06

［中图分类号］363

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.024