传染性鼻气管炎病毒gD基因表位的原核表达与纯化

王 欣，王 琦，齐晓雪， 毕 莹， 倪宏波

( 黑龙江八一农垦大学食品学院， 黑龙江大庆 163319)



传染性鼻气管炎病毒gD基因表位的原核表达与纯化

王 欣，王 琦，齐晓雪， 毕 莹， 倪宏波*

( 黑龙江八一农垦大学食品学院， 黑龙江大庆 163319)

[目的] 对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gD基因表位进行原核表达，并对表达产物进行纯化鉴定。[方法] 利用PCR扩增出gD基因3段表位即gD-A、gD-B、gD-C，并构建原核表达重组质粒pET-28a-gD。将其转入BL21(DE3)表达菌中，IPTG诱导表达。表达的gD重组蛋白经亲和层析纯化后，进行Western blot分析。[结果] 重组表达质粒pET-28a-gD经PCR、双酶切及测序证明构建正确。SDS-PAGE表明，gD蛋白在大肠埃希菌中高效表达，表达的重组蛋白相对分子量约48 ku，与预期的蛋白分子量一致。纯化后的gD重组蛋白浓度为0.128 mg/ml，免疫印迹结果显示纯化后的gD重组蛋白能与IBR标准阳性血清发生特异性反应，说明其免疫原性良好。[结论] 成功表达了gD基因表位蛋白，该蛋白具有良好的反应原性，可作为预防IBR基因工程亚单位疫苗的候选抗原。

IBR；gD；表达；纯化；亚单位疫苗

牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)可引起牛发生急性、热性、接触性传染病——牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)[1]，主要表现为呼吸道和生殖道感染[2-3]。IBRV 主要基因包括gB、gC、gD、gE和TK基因[4]，其中糖蛋白gD位于IBRV囊膜表面，能诱导机体产生保护性抗体[5]，因此gD可作为鉴别诊断IBR的首选特异性抗原[6]。笔者通过大肠杆菌表达IBRV 的gD基因3段表位即gD-A、gD-B、gD-C，为后续诊断方法的建立和亚单位疫苗的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、病毒和质粒

牛肾细胞(MDBK)、IBRV分离株、原核表达载体pET-28a(+)、DH 5α菌种、BL21 (DE3)菌种均由黑龙江八一农垦大学预防兽医学实验室保存。

1.2 血清与抗体

牛传染性鼻气管炎的标准阴、阳性血清均购自中国兽药监察所；辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗牛IgG购自Sigma公司。

1.3 主要试剂和酶

Trizol Reagent、蛋白纯化试剂购自Invitrogen公司； DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自四季青生物工程材料有限公司(杭州)；NheI和HindⅢ限制性内切酶、T4连接酶、DNA快速提取剂盒与质粒提取试剂盒均购自北京博凌科为生物科技有限公司；胶回收试剂盒购自西诺远大科技有限公司(北京)；低分子质量蛋白质Marker和预染低分子质量蛋白质Marker均购自赛默飞世尔(Thermo Scientific)科技有限公司。

1.4 引物的设计与合成

根据GenBank中已发表的BHV-1 gD蛋白的基因序列，利用DNAStar和Prime 5.0设计3对引物，并在引物的 5′端加入相应的酶切位点和保护性碱基，用于扩增gD基因的3个抗原表位，由试剂公司进行合成。

表1 PCR反应的引物和产物大小

1.5 PCR 扩增及基因克隆

采用上述特异性引物对gD-A、gD-B和gD-C分别进行PCR扩增，PCR反应体系为现有技术中常规反应体系。gD基因扩增反应条件：98 ℃预变性 3 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸1 min,35 个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物分别在1%琼脂糖凝胶上电泳分离后，紫外灯下切割目的条带，用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物。

1.6 重组表达质粒构建

用NheI和HindⅢ双酶切重组质粒pMD-gD和原核表达载体pET-28a(+)，连接后转化BL21(DE3)感受态，通过PCR和限制性内切酶酶切进行筛选和鉴定，并送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.7 重组蛋白的诱导表达

将阳性克隆质粒转化进入BL21(DE3)感受态中，获得重组阳性菌，用于蛋白表达，挑取单个阳性菌落接种在含有氨苄的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养。待OD600达到0.6 时，加入 IPTG至终浓度为0.2 mmol/L进行诱导。同时设置表达载体对照组，诱导表达后4 h取菌液，12 000 r/min 离心1 min，保存沉淀。PBS重悬菌体沉淀，超声裂解后，10 000 r/min 离心20 min，收集上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，鉴定目的蛋白是否表达和表达方式。

1.8 表达产物的纯化和浓度测定

将表达的重组菌液4 ℃ 10 000 r/min 离心20 min，弃上清，沉淀用PBS洗2次后，用10%菌液体积的PBS重悬，在冰水混合物中冷却60 min后进行超声破碎(Plus on：5 s，Plus off：15 s)，直到菌液变为清亮，4 ℃ 10 000 r/min 离心20 min，收集沉淀。沉淀用8 mol/L尿素(菌液体积的5%)在冰上重悬沉淀，用移液器反复吹吸，直到完全溶解，4 ℃ 10 000 r/min 离心20 min，除去不溶成分后，加入平衡好的层析柱内，在低温低速振荡器上作用1 h后，垂直放好层析柱，让树脂在重力作用下自然下沉，打开层析柱底端盖帽，让液体逐滴滴下并收集好，在接近液体与层析柱交界面处，关闭层析柱底端盖帽。向层析柱内加入8 ml Denaturing Wash BufferA和B分别重复洗涤3～4次并收集洗涤液，最后用20 ml Denaturing Elution Buffer对层析柱进行彻底洗脱，收集洗脱液及目的蛋白，-80 ℃保存。用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

1.9 Western Blot 鉴定

将纯化后的gD蛋白样品处理后，进行SDS-PAGE凝胶电泳，切去跑完后胶条的多余部分，经电转印至NC膜上，用5%的脱脂奶粉在37 ℃水平摇床上封闭2 h；用5%的脱脂奶粉对一抗所用的IBR标准阳性血清按1∶300倍进行稀释，37 ℃水平摇床上作用1 h；酶标二抗兔抗牛IgG用5%的脱脂奶粉以1∶5 000倍稀释，37 ℃水平摇床上作用1 h；用DAB显色观察结果。

2 结果与分析

2.1 gD基因的PCR扩增结果

PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，在约423、267、57 bp处可见明显的基因片段，与试验的预期大小相符(图1)。

2.2 重组原核表达质粒的双酶切鉴定

构建的pET-28a-gD重组表达载体经NheI/HindⅢ 双酶切可以切出约747 bp的目的片段(图2)。

2.3 gD重组蛋白的SDS-PAGE检测

将诱导的重组菌和空载体进行SDS-PAGE检测，结果显示诱导的重组菌有特异性条带，分子量为48 ku，与预期的蛋白分子量相符，而诱导的空载体却没有该特异性条带，且主要以包涵体的形式表达(图3)。

2.4 gD重组蛋白的纯化

将包涵体蛋白和可溶性蛋白过Ni柱纯化后，目的条带明显。蛋白浓度按照BCA法测定，纯化后的gD重组蛋白浓度为0.128 mg/ml(图4)。

2.5 gD重组蛋白的Western blot检测

将纯化后的gD蛋白转印到NC膜上，进行Western blot 分析检测，结果显示，表达的融合蛋白在48 ku位置出现阳性条带，且所表达的蛋白具有良好的免疫学活性，判定所表达的蛋白为gD融合蛋白(图5)。

3 结论与讨论

利用分子生物学软件对gD全基因及其编码的氨基酸进行分析，通过分析目的基因的酶切位点和预测目的蛋白的跨膜区、信号肽序列及抗原表位等分子生物学特性，在参考相关文献的基础上[7]，选取抗原决定簇较集中且具有良好抗原性和亲水性的序列基因，在gD基因上随机选取3段线性表位，应用引物设计软件，设计出3对特异性引物，成功扩增出3段目的片段。目的蛋白成功表达后，经超声破碎裂解，用亲和层析柱对其进行纯化和浓缩，SDS-PAGE结果显示，目的蛋白的纯度较高，成功扩增出IBR gD部分抗原表位基因，并将其定向克隆到原核表达载体上，并成功表达，经亲和层析柱纯化后，得到了具有良好抗原性且纯度较高的gD融合蛋白，且Western blot检测结果显示，重组的融合蛋白与IBR标准阳性血清能够发生特异性反应，说明得到的重组蛋白具有良好的抗原性，能够作为IBRV检测的优势抗原使用[8]，为牛传染性鼻气管炎的检测和防疫提供了便利条件，同时也为针对该病的诊断试剂盒的研制提供物质基础。

[1] RAAPERI K,ORRO T,VILTROP A.Epidemiology and control of bovine herpesvirus 1 infection in Europe[J].Vet J,2014,201(3):249-256.

[2] GRISSETT G P,WHITE B J,LARSON R L.Structured literature review of responses of cattle to viral and bacterial pathogens causing bovinerespiratory disease complex[J].J Vet Intern Med,2015,29(3):770-780.

[3] MAHAJAN V,BANGA H S,DEKA D,et al.Comparison of diagnostic tests for diagnosis of infectious bovine rhinotracheitis in natural cases of bovine abortion[J].J Comp Pathol,2013,149(4):391-401.

[4] EL-KHOLY A A,ABDELRAHMAN K A.Genetic characterisation of the Egyptian vaccinal strain Abu-Hammad of bovine herpesvirus-1[J].Rev Sci Tech,2006,25(3):1081-1095.

[5] BLANC A M,BEROIS M B,TOMÉ L M,et al.Induction of humoral responses to BHV-1 glycoprotein D expressed by HSV-1 amplicon vectors[J].J Vet Sci,2012,13(1):59-65.

[6] BLANC A M,BEROIS M B,TOMÉ L M,et al.Induction of humoral responses to BHV-1 glycoprotein D expressed by HSV-1 amplicon vectors[J].J Vet Sci,2012,13(1):59-65.

[7] KEUSER V,DETRY B,THIRY J,et al.Characterization of caprine herpesvirus 1 glycoprotein D gene and its translation product[J].Virus Res,2006,115(2):112-121.

[8] BISWAS S,BANDYOPADHYAY S,DIMRI U,et al.Bovine herpesvirus-1 (BHV-1) - a re-emerging concern in livestock: A revisit to its biology,epidemiology,diagnosis,and prophylaxis[J].Vet Q,2013,33(2):68-81.

Expression and Purification of Gene gD of Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus

WANG Xin, WANG Qi, QI Xiao-xue, NI Hong-bo*et al

(College of Food Science,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing,Heilongjiang 163319)

[Objective ]To construct a fusion gene of EnterotoxigenicEscherichiacoli(ETEC) adhesion K99,987P and F41,and purify the fusion expressed protein.[Method]A pair of primers was designed according to the IBRV gD sequences in GenBank to amplify the complete open reading frame.PCR product of gD,containing three epitope: gD-A,gD-B,gD-C,was then inserted into the prokaryotic expression vector pET-28a-gD respectively,then transform the recombinant plasmid into competent cells of BL21 (DE3).After induced by IPTG, the expressed recombinant protein gD was purified by nickel ion affinity chromatography and analyzed by Western blot.[Result]The recombinant plasmid was confirmed by PCR,restriction analysis and sequencing.The expressed recombinant protein with a relative molecular mass of about 48 ku.The concentration of the purified recombinant protein was 0.128 mg/ml for gD.The fusion protein specifically reacted with IBRV polyclonal antibody from mice,indicating good reactionogenicity.[Conclusion] Recombinant plasmid pET-28a-gD is constructed and expressed inE.coliBL21(DE3),indicating that protein gD is potential of candidate antigen for prevention of IBR.

IBRV; gD; Expr

黑龙江省农垦总局攻关项目(HNK125B-11-02；HNK125B-11-10A)。

王欣(1972- )，女，辽宁盖州人，讲师，硕士，从事食品微生物学研究。*通讯作者，教授，博士，从事分子病原学与免疫学研究。

2015-11-11

S 858.23

A

0517-6611(2015)35-231-03