肝脏蛋白质组学的方法学研究进展

樊昊 丁文 徐琰

(郑州大学基础医学院 河南郑州 450001)

“蛋白质组(proteome)”指的是由1个基因组表达的全部蛋白质，1994年Marc Wilkins在意大利Siena会议上提出了这一概念。蛋白质组学(proteomics)是指应用各种技术手段来研究蛋白质组的学科，其目的是从整体的角度研究生物机体、组织、细胞甚至细胞器基因编码的全部蛋白质，包括蛋白的组成、分布、种类、功能、代谢特征及其动态变化规律等［1］。

肝脏是身体内以代谢功能为主的器官，起着去氧化、储存肝糖、分泌性蛋白质的合成等作用。肝病是一种世界范围性的疾病，常见有肝炎、肝硬化、肝脓肿、原发性肝癌等。肝功能的损伤对患者全身器官组织都具有不同程度地损害，严重影响患者的生活。目前还没有人工器官能够完全取代肝脏的功能［2］。

蛋白质是生命活动和生物结构最主要的实际承担者，从整体水平出发的肝脏蛋白质组学研究可更贴近生命本质的去理解肝脏的生命活动规律和特点。同时肝脏蛋白质组学的研究也能为新兴的肝脏基因治疗的发展和临床运用提供帮助［3］。因此，肝脏蛋白质组学的研究备受重视。早在2002年国际蛋白质组第一次研讨会上，我国科学家倡导并提出了开展人类肝脏蛋白质组计划的建议。2007年8月22日，我国科学家成功测定出6 788个高可信度的中国成人肝脏蛋白质，系统构建了国际上第1张人类器官蛋白质组“蓝图”［4］。

随着蛋白质组学研究方法的更新和完善，蛋白质组学研究得以进一步深入。目前已有数种比较健全的蛋白质组学研究体系，而对不同生物体、不同阶段、不同状态的蛋白质组研究需要使用不同的方法。本文将对目前运用于肝脏研究的常用蛋白质组学方法进行简要综述，为研究者提供方法学上的建议，展望蛋白质组学在肝脏研究领域的新空间。

1 蛋白质分离技术

1.1 双向凝胶电泳(two－dimensional electrophoresis，2－DE)常用的2－DE技术主要为二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(two－dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2D －PAGE)以及双向荧光差异凝胶电泳(two－dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，DIGE)。2D－PAGE是目前最为常用的蛋白质组学分离方法之一，实用性高。DIGE则可以对实验组和对照组的蛋白质表达进行更精确且可重复的定量分析。双向凝胶电泳获得的数据已经有专门的系统管理。如:PARIS(proteomic analysis and resources indexation system)系统［5］，储存了电泳图像和信息，可供研究者搜索使用。根据2－DE相关技术，可以对肝脏蛋白质组中的目标蛋白进行分离［6］，在不同的pH值段构建蛋白质参考谱，以便于进一步的分析［7］。对于同种蛋白，借助参考谱的对照，可以确定其亚基(如巯基等)等结构的变化，或者检测其修饰程度［8］。进而在肝病研究中，可以通过分析肝脏疾病中蛋白质的变化，探究蛋白质的变化与肝脏疾病发生的关系［9］。然而，目前2－DE方法还存在着很多缺陷:蛋白质电泳行为易受样品中杂质影响;难溶于样品缓冲液的疏水性蛋白在图谱上难以显示;一些特殊蛋白易在电泳中降解和丢失;实验重复性较差等［10］。故为适应不同组织或细胞的特殊理化性质，需要针对不同来源的样品进行预分离等处理，以获得足够量、高纯度的蛋白质样品用于后续实验。

1.2 高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)HPLC采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，可将液体混合物中的成份分离、成分定性并进行定量分析。其分析速度快，通常分析1个样品在15～30 min;分离效能高;可优化固定相和流动相以达到最佳分离效果;70%以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，其优势十分明显。其不足之处在于分析成本高，分析时间较长。肝脏蛋白质组中的蛋白含量大，种类繁多，低浓度的蛋白不易被检测出。运用HPLC可以精准地检测样品中的目标蛋白［11］，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析。在亚细胞结构中的蛋白分析如检测蛋白质的修饰程度中具有较好前景［12］。同时HPLC在肝脏药物的提取和加工中也有广泛的利用［13］。

1.3 亲和层析(affinity chromatography) 亲和层析是利用亲和力，分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的层析技术。其特异性强、操作简便，对含量少又不稳定的活性物质更为有效，并可得到高产率的纯化产物。但是，只有那些具有配基的生物分子才能用亲和层析分离，具有较高局限性。在肝脏蛋白质组学的研究中，亲和层析技术能够快速高效地分离出特征较明显的目标蛋白(如磷酸化修饰后的蛋白等)［14］。对于已知蛋白的提取和分离具有较好效果。也可以针对凝聚素(如DSA等)，对能与其亲和的不同蛋白质进行研究［15］。

1.4 毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE) CE是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术［16］。CE技术使纳米级的分析成为可能，其系统可实现在线自动分析，一般十几分钟即可完成一次样品分析;同时维持费用较低。其缺点是制备能力差，对复杂样品存在分离不完全的现象。实验中CE常与质谱联用，可以弥补紫外检测器由于通过样品的光程较短导致灵敏度低的问题。肝脏蛋白质组学的研究中，CE技术可用于相对分子质量范围不适于2－DE的样品。相比其他方法CE具有更好的泛用性［17］，对于定量的肝脏蛋白质组学研究效果较好［18］。

2 蛋白质鉴定技术

2.1 质谱技术(mass spectrometry，MS)MS鉴定蛋白质的基本原理是先使样品分子离子化，然后根据不同离子之间的质荷比(m/z)的差异来分离并确定蛋白质的相对分子质量［19］。MS技术具有灵敏、准确、高通量、自动化等特点。质谱技术可达到对蛋白质的快速鉴定和高通量筛选［20］。但是MS还存在固有的局限性，质荷比相似的蛋白质不能区分等。MS广泛运用于肝脏蛋白质组学研究的各个方面。MS可以运用于大规模的肝脏蛋白质组分析，一次性收获大量数据［21］;以肝脏蛋白质峰为模型等进行宏观方向的研究［22］;对于20个氨基酸以下的肽段，MS还能进行翻译后修饰的分析(糖基化、磷酰化)。

2.2 鸟枪法(shotgun)蛋白质鸟枪法是一种自下而上(bottom－up)的技术路线，增进了低丰度蛋白、疏水性蛋白的分离和检测能力;回收率高，可保持蛋白质完整性和活性。该方法可在短时间内获得大量鉴定结果［23］，因此在蛋白质组研究中被广泛采用。其局限性在于:鸟枪法的重复性、可靠性以及信息的详细程度相对较差。鸟枪法能高效地分析肽段上的变化，适用于探究特定模型下蛋白表达的差异以及蛋白修饰程度［24］，以及蛋白质的加成与复杂基体中的活性代谢物的鉴定［25］。但是通过蛋白质直接酶切得到的肽混合物过于复杂，不适合实现对肝细胞全部蛋白质的识别与鉴定。

2.3 同位素标记亲和标签技术(isotope－coded affinitytag，ICAT)ICAT技术在蛋白质组学研究应用较多的便是免疫印迹法(western blot)，利用ICAT技术单独选择某一种蛋白质，检测其表达含量的变化。ICAT技术可以对混合样品直接测试;能够快速定性和定量鉴定低丰度蛋白质;还可以快速找出重要功能蛋白质，其灵敏度和准确性高。但是ICAT对不含半胱氨酸的蛋白质无法分析。其标签试剂本身是种相当大的修饰物，并在整个MS分析过程中保留在每个肽段上，这使得数据库搜索的算法复杂。在肝脏蛋白质组学中，ICAT常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析［26］。同时通过检测蛋白质的表达水平，也可以检测基因表达程度［27］。结合化学发光检测，可以同时比较多个肝组织样品同种蛋白的表达量差异［28］。

2.4 相对和绝对定量同位素标记(isobaric tags for relative andabsolute quantitation，iTRAQ) iTRAQ技术是一种体外同位素标记技术。其优势在于可以对一个基因组表达的全部蛋白质或某个复杂的混合体系中的所有蛋白质进行精确定量和鉴定，用于寻找差异表达蛋白。然而iTRAQ试剂易受杂质蛋白以及缓冲液的污染，需要对样本进行预处理，对操作要求较高。此外还有成本较高等问题［29］。iTRAQ能对目标蛋白进行精确定量分析，在肝脏蛋白质组学的研究中，适用于差异蛋白的定量比较，可用于检测药物疗效，高效监测生物标记物变化［30］。

3 结语

选择正确有效的技术对于蛋白质组学的研究事半功倍。此次选择了关注度较高的数种蛋白质组学的研究方法，在PubMed上搜索近5年来的有关文章数，从中分析有关方法的热度变化。分离方法中，2－DE介于较高的操作难度以及较差的重复性，近年的关注度有所下降;HPLC现已经在金属分析等领域中具有较多运用，在肝脏蛋白质组学研究中颇具潜力;CE以及亲和层析虽热度不高但前景良好。鉴定方法中，MS能提供海量的通量信息，是其他技术所不能比拟的;ICAT及iTRAQ目前运用较多，在定量蛋白分析中具有良好的效果;鸟枪法对于肽段鉴定的效果良好，但在蛋白质整体检测的效果上仍有待提高。希望本文能为诸位肝脏蛋白质组学者在研究方法选择上提供一些帮助。

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