滇龙胆GrWRKY2基因的克隆与序列分析*

(玉溪师范学院 资源环境学院，云南 玉溪 653100)

滇龙胆(Gentianarigescens)为云南道地药材，其主要药效成分为龙胆苦苷.滇龙胆是龙胆泻肝片、苦胆草片等200多种中药的主要成分[1].近年来，龙胆市场需求量剧增，使野生滇龙胆野生资源遭到极大破坏[1].要解决龙胆的药源问题，必须弄清龙胆苦苷生物合成途径及其调控机理，这样才能为通过基因工程生产龙胆苦苷奠定基础.

研究表明,WRKY转录因子能够调控萜类的生物合成.如,在棉花中，GaWRKY1通过激活(+)-δ-杜松烯合成酶而促进棉子酚的生物合成[2];在拟南芥中，AaWRKY1通过激活紫穗槐-4，11-二烯合成酶的合成进而促进青蒿素的生物合成[3];在番茄毛状体中，SlWRKY73主要在根中表达，能够激活萜类合成酶基因SlTPS5的表达[4];在西洋参中，PqWRKY1是三萜人参皂苷生物合成的正调控因子[5].此外,最新研究表明，拟南芥中30%(22/72)的WRKY转录因子都对茉莉酸甲酯处理产生响应，而在长春花中该数字为25%(12/48)[6].此前,通过对滇龙胆的根和叶进行转录组测序分析，笔者发现GrWRKY2基因在叶中强烈上调，因此该基因可能与龙胆苦苷生物合成途径的调控有关.

此外,从目前的研究情况看，国内外学者对龙胆的研究主要集中在种子萌发[7,8]、DNA条码[9,10]、转录因子功能[11,12]、育种[13]等方面，而尚未对滇龙胆GrWRKY2基因进行克隆和表达分析.因此,在本研究中,笔者根据滇龙胆转录组中的GrWRKY2基因序列，设计一对特异性引物，通过RT-PCR技术成功从滇龙胆幼叶中扩增到该基因，并对其进行序列分析.

1 材料和方法

1.1 材 料

本实验所用材料为滇龙胆(Gentianarigescens),其植株栽培于玉溪师范学院分子生物学实验室.RNA提取所用材料为滇龙胆无菌苗幼叶.

1.2 方法

(1)叶片总RNA提取及GrWRKY2基因ORF的克隆.按照多糖植物组织提取试剂RNAiso(Takara，宝生物工程(大连)有限公司)说明书提取滇龙胆幼叶总RNA,按照逆转录试剂盒(Takara，宝生物工程(大连)有限公司)说明书合成cDNA.根据中间表达载体pENTR2B多克隆酶切位点和滇龙胆转录组中GrWRKY2基因序列，设计一对特异引物GrWRKY2BamHI-F：GGATCCATGTCTGACTCTAATTTTTATCAC(下划线为BamHI酶切位点)，GrWRKY2XhoI-R：CTCGAGTCAAATACTAGGGTTTGGATT(下划线为XhoI酶切位点，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成).以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为PrimeSTAR Max Premix(2×，Takara，宝生物工程(大连)有限公司)25 μl，cDNA模板2 μl，正反向引物(10 μmol/L)各1 μl，加ddH2O补足50 μl.PCR反应条件为：98 ℃变性10 s，50 ℃退火15 s，72 ℃延伸5 s，30循环；72 ℃加A尾30 min.PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，然后割胶，使用胶回收试剂盒(Qiagen，德国)对目的片段进行回收，将其连接到pMD19-T载体(Takara，宝生物工程(大连)有限公司).转化大肠杆菌DH5α(Takara，宝生物工程(大连)有限公司)后进行蓝白筛选，挑取白斑摇菌；使用试剂盒提取质粒(百泰克，北京)，经酶切检测正确后进行测序(上海生工，上海)，获得重组质粒pMD19-GrWRKY2.

(2)GrWRKY2基因的生物信息学分析.参考张晓东等[14]的方法对GrWRKY2基因进行生物信息学分析,其中二级结构分析网址为：http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/index.html.

2 结果与分析

2.1 滇龙胆GrWRKY2基因序列的克隆

以滇龙胆幼叶cDNA为模板，使用特异性引物扩增出约400 bp的片段.通过TA克隆获得重组质粒pMD19-GrWRKY2，酶切检测结果表明双酶切获得的两片段大小之和等于单酶切片段大小，与预期相符.

2.2 GrWRKY2基因的生物信息学分析

利用Genetyx、DNAMAN软件对GrWRKY2基因cDNA序列进行分析，结果显示GrWRKY2基因ORF全长362 bp，编码120个氨基酸.将该序列上传至GenBank数据库，获得登录号KM215137.

利用DNAMAN 7软件将GrWRKY2蛋白氨基酸序列与NCBI中相似性较高的部分序列进行比对分析，结果表明GrWRKY2蛋白与已知蛋白序列保守性较高(图1).利用MEGA6.06将GrWRKY2氨基酸序列与其他相似性较高的WRKY序列进行系统发育分析，结果显示滇龙胆GrWRKY2蛋白与琴叶拟南芥AlWRKY15和白菜BrWRKY51亲缘关系较近(图2).

使用ExPASy ProtParam tool对GrWRKY2蛋白进行分析,结果表明:GrWRKY2蛋白单体相对分子质量为13.24 kD，pI为8.29；带正电氨基酸残基(Arg+Lys)为13，带负电氨基酸残基(Asp+Glu)为11，其分子式为C567H907N161O188S8,不稳定指数为38.20，属于稳定蛋白；脂肪指数为71.58，总平均疏水性(GRAVY)为-0.518，为亲水蛋白.分析结果表明还表明,GrWRKY2蛋白含有20种基本氨基酸，其中丝氨酸含量最高，为14.2%,其次是天冬酰胺，为12.5%,色氨酸含量最低，为0.8%.

说明:黑色-相似性等于100%；深灰色-75%≤相似性<100%；浅灰色-50%≤相似性<75%图1 GrWRKY2蛋白与其他植物WRKY蛋白保守区的比对结果

图2 GrWRKY2蛋白与植物中其他WRKY2蛋白的系统发育分析

图3 GrWRKY2蛋白的三维结构预测

利用Sspro对GrWRKY2蛋白进行二级结构分析，结果表明:该蛋白二级结构中α-螺旋(H)占28.33%，无规则卷曲(C)占59.17%，延伸带(E)占12.50%.利用Swiss-Model Workspace,使用自动模式预测GrWRKY2蛋白的三级结构，结果如图3.该模型以拟南芥AtWRKY4[1wj2.1]为模板，在第89～120氨基酸处建模，序列相似度为53.13%.使用InterPro在线工具对GrWRKY2蛋白的保守结构域进行分析，结果表明GrWRKY2蛋白包含DNA-binding WRKY(IPR003657)保守结构域.

利用SignalP 4.1服务器分析GrWRKY2蛋白，未发现信号肽，表明该蛋白为非分泌型蛋白.利用TMHMM工具预测GrWRKY2蛋白的跨膜螺旋区，结果表明GrWRKY2蛋白不含跨膜螺旋区域，为非膜蛋白.使用WoLF PSORT软件进行亚细胞定位分析，结果为GrWRKY2蛋白的定位系数分别为：细胞核5.0，叶绿体3.0，细胞质3.0，分泌途径2.0.

3 讨 论

WRKY蛋白家族的作用比较广泛，主要参与生物胁迫、非生物胁迫、种子发育、种子休眠与萌发、衰老等过程[15].最近的研究结果还表明,WRKY蛋白还参与萜类生物合成的调控[2,3,5].WRKY蛋白的最典型特征是包含“WRKY”结构域，其中W=色氨酸、R=精氨酸；K=赖氨酸；Y=酪氨酸.根据该保守结构域，笔者在滇龙胆数据库中进行搜索，发现了大量的WRKY蛋白，其中GrWRKY2基因在叶中表达量远远高于根，可能参与龙胆苦苷的生物合成.为此，本文对GrWRKY2基因进行克隆和生物信息学分析.但在基因克隆过程中，由于受到DNA聚合酶种类、PCR循环数等影响，往往会导致所克隆的片段发生突变.因此,本研究采用目前保真性最高的酶PrimeSTAR Max Premix，并将PCR循环数设置为30，来最大限度地防止所克隆片段的突变，从而使所克隆的基因序列具有很高的可信度.

使用生物信息学对所克隆的基因片段进行分析，BLAST比对结果和系统发育分析结果均表明所克隆片段为WRKY基因.亚细胞定位分析结果表明，GrWRKY2蛋白可能定位于细胞核，这与西洋参PqWRKY1的细胞核定位结果相一致[5].保守结构域分析结果表明，GrWRKY2蛋白包含DNA-binding WRKY(IPR003657)保守结构域,因此,笔者推测GrWRKY2蛋白可能通过该保守结构域来调控细胞核内基因的表达.

[1]金航,张霁,张金渝,等.滇龙胆[M].昆明:云南科技出版社,2013:1-5.

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