南京辣椒上一种斑驳类型病毒病的分子鉴定

吴淑华， 赵文浩，2， 李廷芳，3， 程兆榜， 潘宝贵， 郭青云， 王述彬， 季英华，周益军

(1.江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏 南京 210014;2.南京农业大学植物保护学院，江苏 南京 210014;3.青海大学农牧学院，青海 西宁 810016;4.江苏省农业科学院蔬菜研究所，江苏 南京 210014;5.青海省农业科学院植物保护研究所，青海 西宁 810016)

辣椒是中国重要的蔬菜作物，常年栽培面积为1.33×106hm2，在蔬菜的周年供应中起着重要的作用。由于辣椒种植面积广，栽培品种多，辣椒上的病毒种类也很多，国外报道至少有45种病毒可以侵染辣椒引起危害［1］，中国早前有报道的病毒包括烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)、烟草蚀纹病毒(TEV)、苜蓿花叶病毒(AMV)、蚕豆萎蔫病毒(BBWV)和烟草脆裂病毒(TRV)等，其中以TMV和CMV最为普遍［2］。2013年姚玉荣等［3］对广东、海南等地的辣椒病毒病进行调查时发现当地的病毒以黄瓜花叶病毒和辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)为主，伴有少量的马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒等。

江苏省辣椒常年栽培面积在8.00×104hm2以上，特别是近年来随着设施栽培技术的推广，辣椒的种植面积也在不断扩大，随之也出现了一些新的病毒病。2014年6-11月，我们在对江苏省南京市辣椒作物上的病毒病进行调查时发现，一种叶片表现斑驳症状的辣椒病毒病在田间非常常见，危害也相对较为严重，对此我们对其进行分子诊断。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试病毒样品 辣椒病样为2014年6-11月采自江苏省南京市表现出斑驳症状的辣椒叶片，样品采集后保存于-70℃冰箱，对照为防虫温室里培育的健康辣椒苗叶片。

1.1.2 试剂 Trizol Reagent购自北京康为世纪生物技术有限公司，反转录试剂盒PrimerScriptTMRTMaster Mix和DNA LA Taq酶购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)，氯仿、异戊醇等其他试剂均为国产分析纯试剂。吸头、离心管等用0.1%DEPC水浸泡过夜后，高压灭菌。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据已报道烟草花叶病毒属(Tobamovirus)成员的序列，分别设计3对引物:烟草花叶病毒属简并引物Tob-Uni1(5′-ATTTAAGTGGASGGAAAAVCACT-3′)和Tob-Uni2(5′-GTYGTTGATGAGTTCRTGGA-3′)，扩增病毒外壳蛋白基因及部分运动蛋白基因，目的片段约800 bp［4］;烟草花叶病毒特异引物TMV-F(5′-TTCTTGTCATCAGCGTGGGCCGA-3′)和 TMV-R(5′-AAGTTGCAGGACCAGAGGTCCA-3′)，扩增病毒外壳蛋白基因，目的片段约440 bp［5］;辣椒轻斑驳病毒特异引物PMMoV-F (5′-AGAACTCGGAGTCATCGGC-3′)和 PMMoV-R (5′-GAGTTATCGTACTCGCCACG-3′)，扩增病毒外壳蛋白基因，目的片段约580 bp［6］，分别用于烟草花叶病毒属成员的检测及TMV和PMMoV的特异性检测。引物委托英潍捷(上海)贸易有限公司合成。

1.2.2 病毒RNA的提取 取0.05～0.10 g病叶于已灭菌的2 ml进口离心管中，加液氮迅速充分研磨成粉状，加入1 ml Trizol Reagent混合，室温放置5 min。加200 μ氯仿、异戊醇混合液(氯仿∶异戊醇=24∶1，体积比)，手摇剧烈震荡15 s，室温放置2～3 min后，4℃12 000 r/min离心15 min。取上清液至1.5 ml离心管中，加等体积的冰异丙醇，混匀，-20℃冰箱放置20 min以上。4℃12 000 r/min离心10 min后弃上清液，用l ml 75%乙醇(0.1% DEPC水配制)洗沉淀2次，每次洗涤后4℃ 5 000 r/min离心5 min。弃上清液，超净台中风干，将RNA溶于35 μl 0.1%DEPC水中，检测RNA的含量和质量后，-20℃保存备用，同时提取健康辣椒叶片总RNA作为阴性对照。

1.2.3 病毒RT-PCR检测 cDNA合成:以提纯总RNA为模板，用PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒反转录合成病毒的cDNA第1条链。RT反应体系:在10 μl反转录反应体系中，PCR管中加入5×PrimeScriptTMRT Master Mix buffer 2 μl，加入含500 ng体积的RNA，用RNase Free超纯水补足到10 μl。轻轻混合，37℃15 min，85℃5 s，反应结束后，将反转录产物-20℃冰箱中保存。

PCR的扩增体系:在25 μl PCR反应体系中，加入10×Buffer 2.5 μl，MgCl21.5 μl，dNTP2.0 μl，cDNA产物1 μl，特异性上下游引物各1 μl，超纯水15.8 μl，LA Taq酶0.2 μl。PCR反应过程为95℃预变性5 min;95℃变性45 s，49℃(Tob-Uni1/Tob-Uni2)或59℃(TMV-F/TMV-R)或54℃(PMMoVF/PMMoV-R)退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。扩增结束后，取5 μl PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳中检测扩增产物，并用培清JS-680D全自动凝胶成像系统记录结果。

1.2.4 序列测定及分析 序列测定委托金斯瑞生物技术有限公司完成，序列分析使用DNAstar软件及 NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/Blast.cgi)上的BLAST程序进行，系统进化分析使用MEGA6完成。

2 结果与分析

2.1 病害田间调查

2014年6-11月，我们在对江苏省南京地区的辣椒病毒病进行调查时发现一种斑驳类型的病毒病在辣椒上非常常见，特别是在管理粗放的田块，该病的发病率较高。该病在辣椒上主要表现为叶片不规则褪绿，伴有黄绿相间的斑驳、叶面凹凸不平、皱缩，有时叶缘上卷(图1)，早期发病的植株常常伴有矮缩症状，对果实产量影响较大，有些辣椒品种的果实上也出现褪绿的斑驳，对果实的品质产生影响。

2.2 烟草花叶病毒属病毒检测

在辣椒上烟草花叶病毒属(Tobamovirus)病毒感染常常造成叶片斑驳花叶等症状，为明确2014年南京采集的样品中是否有Tobamovirus感染，我们对采集到的病样用烟草花叶病毒属简并引物Tob-Uni1和Tob-Uni2进行RT-PCR检测，结果有61份样品扩增到804 bp的预期目的片段(部分样品检测结果见图2)，表明南京地区2014年采集到的辣椒病样中含有烟草花叶病毒属病毒。

图1 感病辣椒样品与健康辣椒样品的对比Fig.1 Comparison of healthy pepper sample and virus-infected pepper sample

2.3 扩增片段的序列测定及分析

为了明确南京辣椒样品上烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的病毒类型，我们随机抽选5份样品进行序列测定并进行同源性分析，发现它们同源性非常高(＞99.1%)，说明它们可能是同一分离物。序列BLAST分析结果显示其与辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)的同源性最高(＞98.3%)，暗示其可能是PMMoV的分离物。将本试验测定序列与Tobamovirus代表性成员(表1)及目前已测定基因组序列的PMMoV各分离物(表2)利用MEGA6比对后进行聚类分析，使用临近法(Neighbor-Joining，NJ)、Kimura 2-parameter模型重建系统进化树(图3)，各个分枝的Bootstrap置信度用1 000次自导复制来评价。

图2 用引物Tob-Uni1/Tob-Uni2得到的PCR检测结果Fig.2 Detection of pepper samples by PCR with Tob-Uni1/Tob-Uni2

由图3可以看出，PMMoV分离物可以分为3簇:西班牙Ia株系单独成为第1簇(Cluster I)，韩国Kr株系、日本 Iw和日本 L4BV株系聚于第2簇(Cluster II);日本C-1421株系、日本J株系、日本TPO-2-19株系、日本Pa18株系、西班牙S株系、中国CN株系、巴西BR-DF01株系及印度HP1株系聚于第3簇(Cluster III)。江苏南京2014年辣椒上检测到的5个分离物分别聚类于第2簇及第3簇，其中NJ14-C11-Tob-1、NJ14-G07-Tob-2、NJ14-G03-Tob-1和NJ14-G08-Tob-2与日本的Iw、L4BV株系及韩国的Kr株系的同源关系较近，共同聚类于第2簇; NJ14-F02-P1与印度的HP1株系及巴西的BR-DF01株系同源关系较近，共同聚类于第3簇。表明2014年江苏南京地区辣椒上分离到的烟草花叶病毒属成员为辣椒轻斑驳病毒。

表1 本试验中所涉及的烟草花叶病毒属病毒序列信息Table 1 Information of Tobamovirus

表2 本试验中所涉及的辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)信息Table 2 Information of pepper mild mottle virus(PMMoV)

图3 根据病毒核苷酸序列一致性构建的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences identities of Tobamovirus

2.4 PMMoV/TMV检测

利用辣椒轻型斑驳病毒的特异性引物PMMoVF和PMMoV-R对田间采集的70份辣椒病样进行RT-PCR检测，结果61份扩增出大小576 bp的预期目的片段，检测结果同简并引物Tob-Uni1和Tob-Uni2的RT-PCR检测结果一致(部分样品检测结果见图4)。对其中代表性样品PCR产物进行序列测定，BLAST序列分析结果显示，其序列与PMMoV有最高的同源性(98%～99%)，表明检测到的病毒为辣椒轻斑驳病毒。

鉴于该病的症状表现主要为斑驳花叶，在中国早期的研究中发现烟草花叶病毒属典型成员——烟草花叶病毒是侵染辣椒导致辣椒病毒病的重要病原，我们也对田间采集的70份病样用烟草花叶病毒的特异引物TMV-F和TMV-R进行RT-PCR检测，结果都没有扩增到目的条带，确定样品没有感染TMV。

图4 引物PMMoV-F/PMMoV-R的PCR检测结果Fig.4 Detection of pepper samples by PCR with PMMoV-F/PMMoV-R

3 讨论

辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)为烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的(+)ssRNA病毒，最早在美国发现［7］，其后在德国、荷兰、英国、西班牙、保加利亚、匈牙利、加拿大、澳大利亚、阿根廷等国均有报道，给辣椒生产造成严重的危害［8］。1994年，中国在新疆辣椒上首次发现该病毒，目前此病毒已蔓延至海南省等地区［3，9-15］。该病毒可以通过种子、植株摩擦汁液传毒，在干燥的植物病残体上可存活25年，带毒的种子、感病植株和病土是重要的侵染来源［15-16］，通过国外种子的引入和种质资源的频繁交流，PMMoV不断蔓延，并且已经在一些地区上升为优势病毒种类［3，15］，成为温室和大棚辣椒的重要致病病原之一［1］，因此在生产上要密切监测该病毒引起的危害情况，加强种子检疫和脱毒处理，及时控制该病毒的蔓延与扩散。

1986年报道南京郊区辣椒病毒病原主要为TMV、CMV，次要为PYV、PVX［17］，1995报道中国六省市辣(甜)椒病毒种群及其分布的研究中，江苏的病原主要为TMV、CMV，次要为PYV、PVX、TRV和BBWV［2］，随后辣椒病毒病病原的演变情况没有查到相关的报道。随着栽培技术的进步，环境的变化，种子资源的交流，病毒的种类也会随之变化。2014年，我们对南京地区采集的70份辣椒病样的检测结果显示，61份样品中检出PMMoV(87.14%)，暗示了PMMoV已逐渐成为南京地区辣椒病毒病(斑驳症状)的主要伴随病毒，之前辣椒上的优势病毒TMV反而未检测到，鉴于该病毒近年来在中国的发生危害逐渐蔓延，生产上应当特别关注。对于本研究中未检测到PMMoV的9份病样，因其田间也表现斑驳等症状，推测可能由其他病原侵染引起。

在对江苏南京地区2014年分离到的PMMoV分离物进行序列分析时发现虽然他们有较高的序列同源性，但是他们分别聚于不同的簇，因此他们有可能属于不同的类型，而且5个分离物中除NJ14-F02-P外，其他4个在系统进化树上与中国之前报道的北京分离物亲缘关系也相对较远，反而与韩国、日本等地分离物的亲缘关系较近，暗示了南京地区PMMoV的来源可能比较复杂。同时由于辣椒上的病毒病种类比较复杂，因此生产上不排除有复合侵染的可能，我们对一些常见病毒的检测中也发现复合侵染的现象，因此要明确辣椒上的病毒病种类需要更大范围的样品普查及多种类型病毒的系统调查。

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