HPLC法测定蛹虫草中虫草素的研究

何巍 缪奇 刘君（四川理工学院,四川 自贡 643000）

HPLC法测定蛹虫草中虫草素的研究

何巍 缪奇 刘君（四川理工学院,四川 自贡 643000）

本文采用超声波法提取蛹虫草子实体中的虫草素，并利用高效液相色谱法测定虫草素。当选择ZORBAX Extend-C18为色谱柱，水-甲醇（95:5）为流动相，流速1.00mL/min,检测波长260nm，进样量10μL作为色谱条件时，虫草素在10-1000μg/mL范围内有良好的线性关系（y=3×107－41890，R= 0.9999），检测限：0.2μg/mL，回收率：102.91%-105.75%，RSD: 2.2616%。

蛹虫草子实体；虫草素；高效液相色谱法

蛹虫草又称北虫草与冬虫夏草同属异种，主要来源于人工培养[1-2]。Yoo、Chor等人发现蛹虫草中的活性成分对人黑色素瘤B16细胞、人白血病HL-60细胞、喉癌细胞具有较好抑制效果，且部分作用优于冬虫夏草[3-4]。蛹虫草子实体已广泛用于虫草类保健品中。目前检测虫草素的方法主要有薄层色谱法[5]、紫外分光光度法及高效液相色谱法。蛹虫草子实体中虫草素含量较低，主要检测方法为用于微量检测的高效液相色谱法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

蛹虫草子实体；日立L-2000高效液相色谱仪；GBC Cintra-4040紫外-可见分光光度计；AS-5150B超声波清洗器；甲醇为色谱纯；水为超纯水；乙醇、甲苯为分析纯；虫草素（中国药品生物制品鉴定所）。

1.2 色谱条件

色谱柱:ZORBAX Extend-C18柱(Analytical 4.6×250nm 5-Micron 80A)；柱温：35℃；流速：1.00mL/min；流动相：水:甲醇（95: 5）；进样量：10μL；检测波长：260nm。采用峰面积外标法定量。

1.3 样品处理

取冷冻后的蛹虫草，取出粉碎，过筛，脱脂，恒温干燥后备用。准确称取样品10g于100mL锥形瓶中，加入适量甲苯-乙醇混合液，放入超声振荡器中，震荡1h，取提取液除去一些含量较高的多糖、蛋白质等杂质，浓缩成浸膏，配成50%的甲醇溶液，定容至10mL，过0.45μL有机微孔滤膜后供色谱分析用。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

对虫草素标准品200-400nm波长范围内进行紫外扫描，结果表明虫草素在260nm有最大吸收，故选择260nm作为检测波长，此时其他物质的干扰小（腺苷在此也有吸收，但在HPLC时能有效分离），方法有较高的灵敏度。

2.2 流动相的确定

在实验过程中选用了水-乙腈、水-甲醇、磷酸缓冲溶液-甲醇不同pH作为流动相，结果表明：中性条件下分离效果较佳且色谱纯有机溶剂用量少、操作简便，节约成本。当水:甲醇体积比为95:5作流动相，保留时间出在可信度较高区域、峰形对称尖锐、检测灵敏度高。其余组分效果均不理想，故选择水:甲醇体积比为95:5作为流动相。以此对提取液进行测定，虫草素与其他杂质能够有效的分开，无干扰，出峰时间适宜，分析稳定。

由于子实体中含有的腺苷和虫草素的结构极其相似，在相同色谱条件下进样腺苷标准品，比较可见，腺苷和虫草素的分离度相当大。

2.3 标准曲线绘制

准确称取虫草素标准品5.0mg，用50%色谱纯甲醇溶解定容于5mL比色管中，得到1.0mg/mL标准品储备液。取储备液分别稀释成0.2、0.15、0.10、0.05、0.01mg/mL的虫草素标准待测甲醇溶液。按照1.2的色谱条件得到峰面积S，以峰面积S对浓度C（μg/mL）作标准曲线，通过线性回归得到回归方程:S=3× 107－41890(R=0.9999)。实验表明:当虫草素浓度在10-1000μg/ mL范围内线性关系良好。检出限0.2μg/mL。

3 结语

本文采用超声波法提取蛹虫草子实体中的虫草素，建立了高效液相色谱测定样品中虫草素含量的方法，样品预处理简单，结果准确，重现性好，精密度高，效果令人满意。本方法对于虫草素的提取生产和质量检测都具有重要的现实指导意义。

[1]温鲁,夏敏等.液体培养蛹虫草虫草素和腺苷的代谢量[J].微生物学通报,2005,32(3)：91-94.

[2]张绪璋.北冬虫夏草的人工培植及其营养成分分析[J].中国食用菌,2003,22(2):19.

[3]Chor SY,Hui AY,To KF et al.J.Ethnopharmacol,2005, 100:180-186.

[4]Heuy-Ling Chu,Jui-Chuan Chien，et al.Protective effect of Cordyceps militaris against high glucose-induced oxidative stress in human umbilical vein endothelial cells.Food Chemistry 129(2011)871–876.

[5]袁永生,张莉,许效枫,等.反相高效液相色谱法测定虫草菌粉中核苷类成分的含量[J].中国药学杂志,2002,37(10): 776.

何巍（1989—），男，汉族，四川阆中市人，在读研究生，单位：四川理工学院化学与制药工程学院制药工程专业，研究方向：药物合成。