豆渣中提取的维生素E 对大鼠运动中骨骼肌的影响

白雪松

(黄山学院 体育学院，安徽 黄山245000)

豆渣是大豆加工成产品，进行浆液分离后得到的副产物，因其口感较差，大多用于饲料中。近年来，豆渣营养成分的研究渐渐成为了一个热点问题。研究发现，豆渣中的膳食纤维含量为50%左右，粗脂肪6%～12%，粗蛋白质15%～20，碳水化合物20%左右，还含有多种蛋白质和维生素，是一种具有多种功能性的物质［1，2］。现阶段，豆渣研究中蛋白较多，对豆渣中维生素E 提取方面缺少深入的研究。

维生素E 又名生育酚或产妊酚，是一种有8 种形式的脂溶性维生素，是人体必需的维生素之一。维生素E 为金黄色或淡黄色的粘稠油状物，具有一种温和的、特殊的气味。维生素E 的机能是多种多样的。目前，国内外消费者对维生素E 的保健功能逐渐重视起来，作为食品工业的营养增补剂受到了人们的认可，维生素E 更适用于生产各种功能保健强化食品，特别是用作运动员的营养补充剂，提高无氧运动后人体力的恢复能力，保持较高的抗氧化酶活性，联合国粮农组织和世界卫生组织都建议人体每天补充适量的维生素E以满足人体的需求［3］。

罗吉伟等［4］研究发现，反复力竭运动导致骨骼肌细胞坏死丢失，线粒体形态异常，口服维生素E 对反复力竭运动大鼠骨骼肌线粒体具有保护作用，减少反复力竭收缩骨骼肌的坏死丢失。宋吉锐等［5］证明维生素E 降低骨骼肌细胞线粒体丙二醛的含量，增加细胞线粒体超氧化物歧化酶的活性，提高骨骼肌细胞的抗氧化能力，进而可减轻自由基对肌肉的损伤作用，维生素E 通过抗氧化作用预防了运动性骨骼肌损伤。国外学者认为，维生素E 的衍生物可增强肌纤维膜、线粒体膜和肌浆网膜的稳定性和完整性，防止肌浆内Ca2+的大量溢出引发的骨骼肌损伤［6］。

本文通过溶剂浸提方法提取豆渣中的维生素E，实现了豆渣副产物的再利用。探讨了浸提时间、不同料液比、浸提温度等对维生素E 提取得率的影响，并通过响应面进行工艺条件优化。豆渣中提取的维生素E用于提高无氧运动中大鼠骨骼肌损伤预防能力的研究，为预防运动损伤提供科学的借鉴。

1 实验材料和方法

1.1 实验材料和试剂

正己烷、丙酮、无水乙醇(化学试剂厂);石油醚、磷酸、异丙醇(西陇化工股份有限公司);菲绕啉(天津一方科技有限公司);三氯化铁(天津市北方天医化学试剂厂);氢氧化钠(郑州金峰达化工产品有限公司);维生素E 标准溶液，质量浓度为1.000g/L 维生素E 标准应用液，质量浓度为0.001g/L(安徽宇宁科技有限公司);成年SD 大鼠50 只，鼠龄10 周，体重220～250g(健康普通级，由长春应化所提供);生长环境温度20 ～25℃，相对湿度50%～70%。

1.2 实验设备与仪器

FA1004A 分析天平 上海达平仪器有限公司;DHG－9140A 型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;LXJ 离心沉淀机 上海精密科学仪器有限公司AFS－230E 原子荧光分光光度计 北京阳光亿事达有限公司;;80－1 电动离心机 金坛市科希仪器有限公司;M11139 旋转蒸发仪 西化仪科技有限公司;HH－600 数显三用恒温水锅 上海谷宁仪器有限公司;PLVW 真空泵 万得勒机械设备有限公司;HPD－25 型固相萃取仪:上海楚定分析仪器有限公司;

1.3 提取工艺和测定方法

豆渣→预处理→乙醇浸提→离心→浸出混合物脱醇并回收乙醇→VE 富集物→丙酮脱胶→离心→旋蒸回收丙酮→脱色→离心去掉脱色剂→皂化→固相萃取纯化→正己烷洗脱液→测定维生素E 吸光度。

较为理想的浸提溶剂需具有较强溶解力强、回收溶液、安全无毒、价格便宜，尽量降低成本与消耗，实验中以正己烷、无水乙醇和甲醇实验室较为常用的溶剂作为单因素条件，将豆渣进行预处理，料液比初选1:3，在60°C 的提取温度下提取2 小时，比较维生素E 的吸光值，选出最佳溶剂［7］。

1.4 标准曲线绘制

1.4.1 标准溶液配制:准确称取10mg 生育酚于小烧杯中，用无水乙醇溶解，加入一定量的抗坏血酸，将其转移至100ml 棕色容量瓶中，定容，摇匀。(质量浓度为100μg/ml)。

1.4.2 梯度配制:将母液浓缩30 倍后，分别取0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml 于10ml 容量瓶中，无水乙醇定容至刻度，使得质量浓度分别为0μg/ml、30μg/ml、60μg/ml、90μg/ml、120μg/ml、150μg/ml 的标准溶液(考虑到仪器性能的限制，吸光度在0.1～0.9 之间时，测量误差较小，因此维生素E 的测定浓度在20 ～150μg/ml 为宜)［8］。

1.4.3 比色:分别取2ml 标准液，加入2g/L 三氯化铁无水乙醇溶液2ml，混合均匀，加入5g/L 1，10－菲绕啉无水乙醇溶液2ml，混匀，静置5 分钟，加入19.6g/L 磷酸无水乙醇溶液2ml 终止反应，在分光光度计520nm下测定吸光值。平行做空白试验。标准曲线测定重复4 次［9］。样品VE 浓度的测定步骤类似。

图1 维生素E 的标准曲线

1.5 大鼠运动方案及训练模型的建立

1.5.1 大鼠分组与运动方案

将50 只大鼠随机分为5 组，对照组10 只(A 组)，采用安静状态下的培育，运动训练组10 只(B 组)，运动训练给药组30 只(C 组)，根据给药剂量不同分为三组:0.1g·kg－1体重(C1)，0.2g·kg－1体重(C2)，0.4g·kg－1体重(C3)，B、C 组按照训练模型进行6 周的游泳运动。

1.5.2 运动训练模型

游泳条件:游泳池水深超过大鼠身体长度的2 倍，水温(30±0.5℃)，每池5 只大鼠。进行正式训练测定前，对大鼠进行3 天适应性训练，训练时间分别为15min、20min、30min，诉后进行正式游泳训练，每天8 次，每次练习游泳10s，休息10s，尾部负重游泳，负重量时间随时间变化，体重13%(1、2 周)、15%(3、4 周)、18%(5、6 周)，观察大鼠运动能力［10］。6 周后第2 日，取样，进行丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)，进行运动后脂质过氧化作用的研究［8］。

1.6 统计分析

2 结果与讨论

2.1 响应面优化实验

2.1.1 响应面优化实验结果

以浸提溶剂、提取次数、提取温度、提取时间和料液比为单因素，确定最佳的提取工艺，以其实验结果为依据，采用响应面中心组合设计，以温度、时间和料液比为条件，以维生素E 浓度为响应值，研究其对豆渣中维生素E 提取率的影响，每个因素设三个水平，因素水平表见表1。

表1 响应面优化因素水平表

表2 Box－Behnken 试验设计及结果

表3 试验结果回归分析

依据Box－Behnken 试验设计方案，采用三因素三水平试验设计法进行工艺优化，其试验组合及结果如表2 所示，方差分析显著性检验结果如表3 所示。

据表2 结果计算各项回归系数，以回归系数建立维生素E 浓度与提取时间A、提取温度B 和料液比C 3个因子的数学回归模型，模型回归检验F=68.73，在0.01 水平上差异极显著。失拟检验F=19.89，差异不显著，模型具有统计学意义。编码因素A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2差异显著，优化模型的编码方程为:y=7.79－1.07A－1.01B+1.75C－1.12AB+1.39AC+0.90BC－1.19A2－1.96B2－1.23C2，从回归方程可知，方程一次项为高度显著因素，即提取温度，、提取时间和料液比对维生素E 的得率有高度显著影响;二次项A2、B2、C2极显著(P＜0.01)，即三因素之间存在明显的二次关系。

2.1.2 响应面分析与优化

根据二次回归方程绘制的响应面结果如图2 所示:

图2 大豆豆渣的提取响应面图

从图2a 可知，提取时间和提取温度之间有高度显著的交互作用(P＜0.01)，在选定的条件范围内，提取效果较好的值都落在了提取时间和提取温度的中间区域。保持提取时间固定，维生素E 浓度随温度增大而增大，在65～68℃达最大值;保持提取温度固定，样品维生素E 浓度随提取时间延长而增加，100min 时达最大值。

从图2b 可知，提取温度和提取料液比之间有高度显著的交互作用(P＜0.01)，在选定的条件范围内，提取效果较好的值都落在了提取时间和料液比的中间区域。保持提取时间固定，维生素E 浓度随料液比减小而先增大后减小，在0.40～0.45 达最大值，之后逐渐减少;保持料液比固定，样品维生素E 浓度提取时间增加而增大，100～110min 达最大值。

从图2c 可知，提取时间和料液比之间有高度显著的交互作用(P＜0.01)，提取效果较好的值都落在料液比和提取时间的中间区域。保持提取时间固定，维生素E 浓度随料液比增加而增大，0.40 ～0.45 时达最大值;保持料液比固定，维生素E 浓度随提取时间延长而增大，65℃左右时达到最大值，后呈下降趋势。

结合回归模型的数学分析可知，豆渣蛋白提取的最优工艺参数为提取温度为67.78℃，提取时间为100.30min，提取料液比为1:2.37，在此工艺基础上，预测豆渣中维生素E 的浓度为8.32μg/100g。为进一步检验响应面分析结果的可靠性，采用上述最优条件进行验证实验，实际测定样品豆渣中维生素E 浓度为8.01μg/100g，与理论值相比，误差较小，因此，采用响应面分析优化得到的提取条件参数准确可靠，可用于实际操作。

2.2 维生素E 对大鼠运动中骨骼肌的影响

表4 摄入维生素E 浓度对大鼠体重及负重游泳时间的影响

表5 游泳后骨骼肌细胞线粒体中的丙二醛含量(MDA)、超氧化物歧化酶活力(SOD)

由表4 可知，结束时，大鼠的体质量有所增加，但大鼠的初始时体质量与结束时体质量，各组之间不存在显著性差异(P＞0.05)，所以维生素E 未引起体重的过快增长，且未影响大鼠的正常发育。运动中，自由基的变化与骨骼肌微损伤有着密切的关系。由表5A、B 可知，大鼠运动后骨骼肌线粒体中的MDA 和SOD 均显著升高。C1，C2 组与A 与的MDA 差异不显著，故维生素E 的给药使自由基的生成明显减少，机体细胞膜的稳定性增强;C 组与A 组的SOD 皆存在显著性差异，C2、C3 组与B 组亦存在显著性差异，故维生素E 的给药能保持机体的抗氧化活性，通过抗氧化作用提高机体损伤的预防作用。

3 结论

维生素E 是一种强抗氧化剂，其有许多功效，最突出的化学性质是抗氧化作用。通过单因素和响应面优化，得到豆渣蛋白提取的最优工艺参数为提取温度为67.78℃，提取时间为100.30min，提取料液比为1:2.37，在此工艺基础上，预测豆渣中维生素E 的浓度为8.32μg/100g，实际测定浓度为8.01μg/100g。此外，用豆渣中提取的维生素E 进行了对大鼠运动中骨骼肌细胞线粒体中的丙二醛含量(MDA)、超氧化物歧化酶活力(SOD)的变化研究，结果显示，给药的大鼠负重游泳时间显著增加，延缓运动中MDA 的增加，保持较高的SOD 活性，提高了运动中机体的抗氧化活力，对运动中的微损伤的预防有着重要的作用。

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