规模化肉鸡场常见呼吸道病原体感染状况调查

朱明霞,牛玉娟,马海营,吕传位,张清林,刘思当*

1.聊城大学农学院,山东聊城252059

2.山东农业大学动物科技学院,山东泰安271000

3.泰山职业技术学院,山东泰安271000

规模化肉鸡场常见呼吸道病原体感染状况调查

朱明霞1,牛玉娟2,马海营2,吕传位2,张清林3,刘思当2*

1.聊城大学农学院,山东聊城252059

2.山东农业大学动物科技学院,山东泰安271000

3.泰山职业技术学院,山东泰安271000

呼吸道疾病尤其是常见的禽流感、新城疫、传染性支气管炎是危害养鸡业最严重的疾病之一。为了解肉鸡初期呼吸道病病原体的感染状况，从2万孵化的鸡胚中采集了210枚弱、死胚样品及5日龄有呼吸道症状的48只病死鸡。用RT-PCR方法对这两批样品进行了H9N2亚型禽流感病毒(H9N2AIV)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒（IBV）感染状况的检测，又将5日龄的雏鸡进行了大肠杆菌（Escherichia coli）及沙门氏菌（Salmonellaspp.）分离鉴定，分析检出率。结果表明，在210枚鸡胚样品中H9N2 AIV、NDV和IBV的检出率分别为3.81%，21.9%和23.8%，弱、死胚样品常见呼吸道病病毒感染率高达49.51%。5日龄雏鸡样品中H9N2AIV、NDV、IBV、E.coli和S.spp.的检出率分别为45.8%，37.5%、10.4%、54.2%和8.3%，未发现3种病毒共感染的现象，但是病毒与细菌的共感染率达58.3%，主要是大肠杆菌与病毒的双重感染。呼吸道病毒一般能将鸡胚在孵化过程中致死，但若含病毒的鸡胚没能死亡，雏鸡出壳后发育到一定时期（母源抗体衰竭后）所含病毒会大量复制，进而发生相应的呼吸道疾病，在鸡群中迅速传播，并继发其他细菌性疾病，造成鸡群大批死亡，这是肉鸡中后期呼吸道疾病日益严重的重要原因。

肉鸡;鸡胚;呼吸道病原;感染;PCR

肉鸡呼吸道疾病属多病因呼吸道病综合征，常造成肉鸡养殖的严重损失，死淘率可达30%以上，并造成发病鸡生长迟缓、胴体降级或废弃，而成为危害肉鸡养殖业的重要疾病[1,2]。肉鸡呼吸道病病因极为复杂[3-5]，既有水平传播性疾病，也有垂直传播性疾病，常见的有H9N2亚型禽流感病毒(H9N2AIV)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒（IBV）、大肠杆菌（Escherichia coli）和沙门氏菌（Salmonellaspp.）等，其中3种病毒是否能经卵垂直传播尚存在争议[6,7]。本研究从山东某大型肉鸡养殖公司的210枚弱、死鸡胚及48只雏鸡样品中，用PT-PCR和细菌分离鉴定方法检测5种病原的感染率，以期为商品肉鸡呼吸道病的病原学分析及防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

210枚弱、死鸡胚和48只5日龄淘汰弱死雏鸡样品，采自山东省某大型肉鸡养殖集团公司；9日龄SPF鸡胚购自济南家禽所。

1.2 试剂

Trizol试剂购自Invitrogen公司；rTaq DNA聚合酶、AMV反转录酶、dNTP、RNA酶抑制剂、DNA Marker购自大连宝生物工程有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、EDTA、琼脂糖，购自Sigma公司；营养肉汤、伊红美蓝培养基、SS培养基、革兰染色液；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 病料的处理无菌采取雏鸡的肝脏、肺脏及弱、死胚的肺脏，将肺脏分别在灭菌的乳钵内充分研磨，用灭菌生理盐水制成1:3乳剂，4℃条件下5000 r/min离心5 min，取上清液，加入2000 IU/mL青霉素、链霉素。反复冻融3次，-80℃保存备用。

1.3.2 鸡胚接种上述病料经尿囊腔接种9日龄鸡胚，0.2 mL/枚，另设阴性对照。弃除24 h内死亡胚，观察3～5 d，每天记录结果，收取24 h后死亡胚的尿囊液，于-80℃冷冻保存、备用。

1.3.3 病毒RNA的提取250 μL鸡胚尿囊液中加入750 μL Trizol，剧烈震荡1 min，室温静置5 min；向上述体系中加入300 μL氯仿，剧烈振荡1 min，室温静置3 min；12000 r/min，4℃离心15 min；取上清（约500 μL）置于一个新的DEPC处理过的1.5 mL离心管中，加入500 μL异丙醇，混匀后室温沉淀30 min；12000 r/min，4℃离心15 min；弃上清，加入1 mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀物，12000 r/min，4℃离心10 min；弃上清，室温空干后加入30 μL DEPC水溶解沉淀。-80℃保存备用。

1.3.4 细菌分离鉴定将48份肝脏分别无菌勾取接种于营养肉汤中37℃增菌16 h，再将增菌肉汤分别划线接种于伊红美蓝和SS营养琼脂上培养24 h，观察细菌生长情况，挑取单个可疑菌落涂片革兰氏染色镜检。

1.4 聚合酶链反应（PCR）检测

1.4.1 引物设计与合成根据Gen bank已发布的H9N2AIV、NDV和IBV的序列，利用Primer 5.0软件设计并合成了3对特异性引物（表1），分别用于检测。引物由上海生工公司合成。

表1 引物序列Table 1 Sequence of primers

1.4.2 RT-PCR扩增反转录(RT)的反应体系为10 μL：RNA悬浮液5 μL，加入1 μL随机引物，混合后于70℃温浴10 min后，置冰上2 min，依次加入5×反转录缓冲液2 μL，RNA酶抑制剂0.25 μL，dNTP混合物0.5 μL，5×反转录酶0.5 μL，最后加水0.75 μL，混匀后于42℃水浴1 h，70℃于温浴15 min后，置冰上冷却，得到cDNA。用制备的cDNA进行PCR，采用25 μL PCR体系：反转录产物cDNA3 μL,10×ExTaq反应缓冲液2.5 μL，dNTP混合物2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，灭菌双蒸水15 μL，混匀，加入ExTaq DNA聚合酶0.5 μL，经94℃5 min预变性后进行PCR循环，ND和IB的反应程序为：94℃30 s，54℃30 s，72℃30 s，35个循环，72℃延伸10 min；H9的反应程序为：94℃30 s，59℃30 s，72℃90 s,35个循环，72℃延伸10 min。

反应结束后，取5 μL PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

2 结果

2.1 肉鸡初期5种呼吸道病病原体的感染情况

由表2鸡胚样品中H9N2AIV、NDV和IBV3种病原体的检测结果可以看出，210枚弱、死胚样品中IBV的检出率最高为23.8%，H9N2的检出率最低为3.81%，NDV的检出率为21.9%。未检测到共感染现象，弱、死胚样品常见呼吸道病病毒感染率高达49.51%。图1为部分样品的PCR凝胶电泳图。

由表3雏鸡样品中5种病原的检测结果分析，大肠杆菌的检出率最高54.2%，其次H9N2为45.8%，NDV、IBV和S.spp.的检出率分别为37.5%、10.4%和8.3%。单独感染一种细菌和三重感染的样品未检测出，单独感染H9N2、NDV和IBV比例分别是10.4%、12.5%和4.17%，两种细菌均是与病毒形成双重感染，以H9N2+E.coli和NDV+E.coli最为常见，感染比例为31.25%、20.8%。

表2 鸡胚中3种呼吸道病原体的感染结果Table 2 Results of the detection rate of infection of three pathogens from embryonated eggs

表3 雏鸡5种呼吸道病原体的感染结果Table 3 Results of the detection rate of infection of five pathogens from broilers

图1 鸡胚中3种病原PCR凝胶电泳部分结果M:2000 bp Mark；Y:阳性对照；-:阴性对照Fig.1 Detection result of three respiratory pathogens of some samples by PCRM:2000 bp Mark;Y:Positive control;-:Negative control

3 讨论

本研究对210枚弱、死肉鸡胚和5日龄雏鸡进行了H9N2 AIV、NDV、IBV、E.coli和S.spp.的感染情况调查，结果显示：鸡胚中存在较高比例的3种病毒性呼吸道病原单独感染的情况，但未检测到共感现象；5日龄的雏鸡中E.coli感染尤为严重，均与NDV和H9N2AIV混合感染。国内外学者已证实，鸡首先单独感染了H9N2、NDV或IBV后，会为细菌性或病毒性病原体的入侵创造条件：大肠杆菌、鸡毒支原体、波氏杆菌等是最常见的继发感染菌且常造成慢性和持续性的感染[8-11]；受到感染的鸡体抵抗力下降，已侵入机体的病毒毒力会显著增强且在鸡群中迅速传播[12]。因此，鸡胚中携带高比例的H9N2、NDV和IBV应引起我们的高度重视。

本实验检测到弱、死鸡胚中H9N2 AIV的分离率（3.81%）较低，而5日龄的弱死雏鸡分离率（45.8%）极高，分析主要是源于环境污染，因此鉴于禽流感对我国养鸡业的重大威胁以及公共卫生考量，所以还是要定期进行免疫效果检测，及时调整免疫程序，以有效防止该病的发生流行，即使是低致病性禽流感也应引起我们的高度重视。另外鸡胚和雏鸡中检出NDV的比率相差不大，说明胚中有较高比例的病毒感染率，这将对孵出的雏鸡具有很大的危险性，该类病毒传染性强，可导致其他健康的雏鸡感染，在受到应激或其他不良因素刺激作用时，会发生严重的继发性细菌病或病毒病，从而造成更大的经济损失。近年来的研究发现[13-15]，不同呼吸道病原体感染是目前商品肉鸡呼吸道疾病的基本特征，雏鸡携带病毒对肉鸡呼吸道疾病发生有着不可推卸的责任。从鸡胚携带病毒的检测结果可以推测种鸡场肯定也存在较为严重的H9N2、NDV和IBV的感染，3种病毒可以通过水平传播在鸡群中扩散，造成大规模的种鸡感染，由于种鸡群均对上述3种疾病采取高密度免疫，抗体水平较高，多呈隐性感染状态，对商品肉鸡养殖构成了重大的潜在威胁。

实践表明，降低鸡苗带毒率是商品肉鸡呼吸道病防控的关键环节，做好种鸡的免疫、净化工作是防止鸡苗带毒的有效措施；做好种苗的引种检疫、搞好日常饲养管理、健全生物安全体系以及平时做好疾病监测评估是种鸡健康养殖的综合措施。及时淘汰患病种鸡，必要时采取种鸡净化措施，淘汰隐性带毒种鸡，另外，要做好种蛋的及时消毒处理。商品肉鸡场要购买健康鸡苗，加强鸡苗的带毒监测，坚持使用正规厂家疫苗，科学制定疫苗免疫程序，防止养殖环境的病原污染，减少鸡群的应激危害因素，最大限度的降低呼吸道病的发病率。

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Epidemic Investigation for the Infection Avian Respiratory Disease Pathogens from a Large-scale Chicken Farm

ZHU Ming-xia1,NIU Yu-juan2,MA Hai-ying2,LV Chuan-wei2,ZHANG Qingl-lin3, LIU Si-dang2*
1.Agricultural College of Liaocheng University,Liaocheng252059,China
2.College of Animal Science and Technology/Shandong Agricultural University,Tai’an271000,China
3.Taishan Institute of Technology,Tai’an271000,China

Avian respiratory infection plays a prominent role in damaging the poultry industry,especially the Avian flu, Newcastle disease and chicken infectious bronchitis.210 lung samples of dead or weak broiler embryo and 48 lung and liver samples of broilers with respiratory symptoms were collected from a large-scale broiler farm,and then RT-PCR was used to detect H9N2 subtype of Avian influenza virus(H9N2 AIV),Newcastle disease virus(NDV)and infectious bronchitis virus (IBV),Escherichia coliandSalmonellaspp.were separated from 48 chicks.The results show that the detection rates of the three pathogens of the 210 lung samples of embryo were 3.81%(H9N2 AIV),21.9%(NDV),23.8%(IBV)and respiratory tract viral infection rates were up to 49.51%.The detection rates of the five pathogens of the 48 lung and liver samples of broilers were 45.8%(H9N2 AIV),37.5%(NDV),10.4%(IBV),E.coli(54.2%),S.spp.(8.3%)and the co-infection of the three virus were not detected,while the ratio of co-infection between virus and bacteria was up to 58.3%especiallyE.coliplayed an important role in the co-infection.The chicken embryos were easier to die during incubation with respiratory viral, but if not die the chicks developed to a certain period(the maternal antibody failure)while the virus could proliferation then respiratory diseases would happen and spread rapidly in chicken flocks with bacterial infection resulted in a large number of deaths,which is an important cause of late respiratory illness increasingly serious in broiler chickens.

Chicken;chick embryo;respiratory tract pathogen;infection;PCR

S852.35

:A

:1000-2324(2015)06-0861-04

2014-08-11

:2014-08-20

山东省高等学校科技计划项目(J14LF03)

朱明霞(1978-),女,山东茌平,副教授,研究方向家禽疫病发生机理与防控.Email:1538054669@qq.com

*通讯作者:Author for correspondence.E-mail:liusid@sdau.edu.cn