猪流行性腹泻病毒基因组研究进展

赖婷婷，陈　樨，张如梅（福州大北农生物技术有限公司，福建福州350014）



猪流行性腹泻病毒基因组研究进展

赖婷婷，陈樨，张如梅
（福州大北农生物技术有限公司，福建福州350014）

摘 要：猪流行性腹泻病毒（PEDV）为冠状病毒属（Coronavirus）不分节段的单股正链RNA病毒，对仔猪具有较高的致死率。发病仔猪表现为呕吐、腹泻和脱水等临床特征。随着分子生物学的进步和测序技术的发展，大量的猪流行性腹泻毒株基因组序列被测定，极大丰富了该病的分子流行病学信息。论文结合近年来关于猪流行性腹泻基因组（尤其是主要抗原变异区S基因）结构特征做一简要综述，为丰富究猪流行性腹泻病毒分子流行病学特征和疫苗研究奠定基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒；基因组；S基因

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）属于尼多病毒目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状病毒亚科（Coronavirinae）、α属冠状病毒（Alpha coronavirus）属。α属冠状病毒属有8个代表种，即α冠状病毒1型（Alphacoronavirus 1）、人冠状病毒229E（Human coronavirus 229E）、人冠状病毒NL63（Human coronavirus NL63）、长翼蝙蝠冠状病毒1型（Miniopterus bat coronavirus 1）、长翼蝙蝠冠状病毒HKU8型（Miniopterus bat coronavirus HKU8）、猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus）、菊头蝙蝠冠状病毒HKU2（Rhinolophus bat coronavirus HKU2）和黄蝠冠状病毒512（Scotophilus bat coronavirus 512）［1-2］。

PEDV为不分节段的单股正链RNA病毒，其基因组大小约为28kb。其基因组5′-端有帽子结构，3′-端有多聚A尾，其从5′→3′依次为5′-UTR（非编码区，Untranslated region，UTR）-ORF1（replicase）-S （spike）-ORF3-E（envelop）-M（membrane）-N（nucleocapisd）-3′-UTR［3-5］。

1　5′-非编码区和3′-非编码区

猪流行性腹泻病毒PEDV5′-UTR长短不一，其长度不同对病毒生物学特性的有无影响还未见报道明确。PEDV 5′-UTR核苷酸长度在291bp～296bp之间，其内部含有一个39bp（pos.99～137）小开放阅读框（ORF，open reading frame），编码12个氨基酸的多肽（MFMLLEAGVEFH），在所有测定的冠状病毒属5′-UTR均存在这一特征。猪流行性腹泻病毒PEDV3′-UTR位于病毒3′-端，在测定的PEDV基因组中，该处的长度均为334bp，在其多聚A尾上游存在一个在所测定的冠状病毒属中均存在的八聚体序列（GGAAGAGC）。和PEDV5′-UTR基因存在核苷酸缺失和插入现象不同，但存在有核苷酸的点突变，其相关生物学功能还有待明确［6］。

2　ORF1基因

ORF1基因编码病毒的复制酶（replicase），约占PEDV基因组全长的2/3，包含2个主要的ORFs （ORF1a，ORF1b）。其中ORF1a长短不尽相同，其核苷酸长度在12 330bp～12 354bp之间，编码452.82 ku（12 354bp）多聚蛋白1a（polyprotein 1a，PP1a）；ORF1b长短在测定的序列中保持一致，核苷酸长度均为8 037bp，编码29.46ku多聚蛋白1b（polyprotein 1b，PP1b）。ORF1a编码蛋白还含有3个转膜域（TM）。ORFlb主要编码RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp），同时有3个蛋白结构域分别是锌指蛋白域（Zn）也称金属结合域、螺旋酶域（Helix）和保守序列域（C）［6-7］。

ORF1a和ORF1b有46nt的重叠区，形成一个独特的“假结（slippery）”结构［8-9］，该特殊的结构可引起核糖体在ORF1a/ORF1b连接处的7碱基滑序列（UUUAAAC）发生移码突变，导致该处病毒编码区发生改变，形成一个由ORF1a和ORF1b共编码多聚蛋白1ab（polyprotein 1ab，PP1ab），长度约为753.08ku，对多聚蛋白切割产生具有功能产物的蛋白酶切割作用。

3　S基因

S基因编码病毒的纤突蛋白（spike），该基因的启动密码子通常并不是用于启动蛋白质的合成，而是翻译分子质量为1 383个氨基酸编码的多肽。S基因核苷酸长短不一，其核苷酸长度在4 143bp～4 161bp之间。目前，关于PEDV的S基因的分子流行病学数据研究较多，通过研究发现，S基因可用来作为PEDV基因分型的一个依据，可将其分为2个大的基因群，G1基因群和G2基因群，各个亚群均可细分为2个小的遗传分支，即G1-1、G1-2和G2-1、G2-2。研究还发现，G1基因群均存在有碱基缺失或插入现象（以基因插入为主）；而G2基因群则不同，其主要存在有碱基缺失（3bp或6bp）现象［10-11］。

氨基酸分析表明，G1基因群PEDV毒株既存在大量的氨基酸点突变外，又存在氨基酸插入和缺失现象；但G2基因群PEDV毒株却不存在氨基酸插入现象，以氨基酸点突变为主。G1基因群PEDV毒株氨基酸序列与CV777（G2基因群代表株）的同源性为93.0%～93.8%；G2基因群PEDV毒株氨基酸序列与CH/BJYQ/2011（G1基因群代表株）的同源性为95.2%～96.2%，而CH/BJYQ/2011与CV777的同源性最高为93.8%。由于PEDV只有一个血清型，氨基酸的变异并不会对血清型产生影响，但推测其和疫苗的推荐使用密切相关［12］。

对PEDV新流行株的S基因序列分析发现，PEDV流行株S基因已出现缺失（197aa）和插入（4aa），表明随着疫苗的使用，PEDV基因组进化趋势增强［11］。以S基因绘制PEDV遗传进化树发现，PEDV可分为2个明显的分支G1和G2，G1分支主要是CV777、DR13等活疫苗株和PEDV早期分离株，而G2分支均为新PEDV流行株，主要在韩国、美国等地流行［10］。

4　ORF3基因

ORF3编码223或224个氨基酸多肽，是PEDV基因组编码唯一的1个辅助蛋白，与冠状病毒毒力强弱密切相关，其编码的产物或许是一种未知的病毒包膜（envelope）蛋白，与病毒毒力有关［13］。通过比较ORF3全基因核苷酸序列可见，2株弱毒疫苗株CV777和DR13弱毒株均存在有连续核苷酸缺失，但缺失并不是完全相同的，为强、弱毒鉴别诊断方法的建立提供了依据。

由于ORF3中核苷酸缺失的存在，所以不能寄希望通过细胞培养复制ORF3产物。在ORF3序列中还发现2个功能基序（motif）：精氨酸酶信号肽和ATP/GTP结合位点，将其植入AKP基因，原核表达为异源二聚体融合蛋白［14］。

5　E基因

E基因全长为231bp，编码病毒囊膜上的小包膜蛋白，推测其在病毒的自我组装和出芽过程中起至关重要的作用。

6　M基因

M基因全长为681bp，编码226个氨基酸的跨膜蛋白。M蛋白可诱导宿主产生特异性抗体（没有病毒中和活性），能介导机体产生干扰素，可作为PEDV基因工程疫苗的候选基因［15］。此外，不同基因群PEDV的M基因相互之间同源性较高，该基因常备要来作为PEDV诊断的候选靶基因。研究发现，利用M蛋白制备单抗（MAb）能够识别重组与天然M蛋白，可与Vero E6细胞感染的PEDV毒株产生特异荧光。

7　N基因

N基因全长为1 326bp，编码441个氨基酸的N蛋白。N蛋白是一种RNA结合蛋白，富含碱性氨基酸（如赖氨酸和精氨酸）残基而表现出高度的碱性。N蛋白是冠状病毒已知结构蛋白中唯一的磷酸化蛋白，丝氨酸残基是潜在的磷酸化点。PEDV N蛋白磷酸化会病毒的二级结构。此外，在碱性环境下会引入负电荷，会影响蛋白的RNA结合活性。PEDV N蛋白能在宿主细胞的细胞核中存在，说明N蛋白中存在引导蛋白质到细胞核定位的信号；进一步研究发现N蛋白能与感染细胞中细胞核磷蛋白的共定位于细胞核细胞核磷蛋白（B23.1）［16-17］。

在感染PEDV的早期，动物体内就能产生抗N蛋白的较高水平的抗体，而且N蛋白的保守性高，利用N蛋白为基础来建立PEDV的分子生物学诊断技术具有很好的应用前景。研究表明，S蛋白备的S蛋白和N蛋白可用作ELISA抗原，分别建立S-ELISA 和N-ELISA，感染PEDV猪血清中的抗S蛋白抗体比抗N蛋白抗体更为持久［18-19］。

研究发现，不管接种PEDV灭活疫苗还是活疫苗对降低腹泻率影响不大。通过更进一步的S基因序列测定分析发现，当前猪群中的PEDV流行株（2011 年-2013年）和经典疫苗株CV777之间核苷酸低于95%，但流行株之间的核苷酸同源性在97.8%以上［20］。结果表明，随着CV777广泛使用，导致PEDV流行株承受一定的抗压选择，已和疫苗株存在有较大变异，进化成独特分支［21-22］，提示在研发和使用PEDV疫苗应转变研究思路，并应在疫苗使用时加强对PEDV的流行病学监测和对疫苗效果进行有效评估。

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Progress on Genome of Porcine Epidemic Diarrhea Virus

LAI Ting-ting，CHEN Xi，ZHANG Ru-mei
（Fuzhou Dabeinong Biotech Limited Company，Fuzhou，Fujian，350014，China）

Abstract：Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）is an unsegmented，positive strand RNA virus，which can be cultured in Vero cells and cause high mortality in piglets.The disease is characterized by vomiting，diarrhea and dehydration.According to the progress on molecular biology and genome sequencing technology，especially the research for the spike gene，many PEDV viruses were sequenced，which make us know more clearly about the PEDV molecular epidemiology.This article summarized the research progress on the genomic structure and function proteins of PEDV，providing references for research and control to PEDV.

Key words：Porcine epidemic diarrhea virus；genome；spike gene

作者简介：赖婷婷（1985-），女，福建永安人，硕士研究生，主要从事动物疫病防治研究。

基金项目：福建科技重大专项（2013Y31010019）

收稿日期：2014-11-04

中图分类号：S852.659.6

文献标识码：A

文章编号：1007-5038（2015）06-0119-03