survivin在肝癌细胞株Hep G2表达与化疗药物敏感性的关系

梁 瑞,孟宏涛,段 炜,王家林, 李战宁，徐文焕

survivin在肝癌细胞株Hep G2表达与化疗药物敏感性的关系

梁 瑞1,孟宏涛2,段 炜2,王家林1, 李战宁2，徐文焕3

目的 探讨肝癌细胞株Hep G2中凋亡抑制因子survivin与化疗药物敏感性的关系。方法 通过MTT检测肝癌细胞株Hep G2对于1.0 μg/ml顺铂, 1 μmol/L阿霉素，及1.0 μg/ml吉西他滨的敏感程度；通过Western blot 检测Hep G2中survivin 蛋白在顺铂、阿霉素、吉西他滨处理后不同时间段表达水平的变化。结果 在药物作用72 h后，10%～20%的肝癌细胞仍然存活并具有代谢活性。顺铂和吉西他滨处理48 h后survivin蛋白表达升高(2.04±0.05vs1.25±0.05；1.84±0.02vs1.25±0.05；1.92±0.05vs1.55±0.04；1.88±0.11vs1.55±0.04,差异有统计意义(P<0.05)。阿霉素处理48 h后survivin 蛋白表达并未见明显变化(1.73±0.11vs1.52±0.02；1.66±0.12vs1.52±0.02),差异无统计学意义。结论 survivin 蛋白水平升高与肝癌细胞株Hep G2部分化疗药物敏感性相关。

肝癌;survivin;顺铂;吉西他滨;阿霉素

目前，全身化学药物治疗(化疗)和动脉局部化疗是肝癌治疗的主要手段，但是对患者的生存率没有明显的提高，这可能与化疗药物对肝癌细胞的敏感性有关。越来越多的研究结果表明，化疗药物的敏感性与肿瘤细胞的抗凋亡能力密切相关[1]。survivin是目前最强的凋亡抑制因子，很可能与化疗药物的敏感性有一定的关系。笔者于2014-07至2014-09通过对比化疗药物处理前后肝癌细胞株Hep G2中survivin表达变化，旨在探讨它与化疗药物敏感性的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞株和药物浓度 人肝癌细胞株Hep G2，使用RPMI 1640培养,含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素，2 mmol/L谷氨酰胺。顺铂(江苏豪森药业)、阿霉素(浙江海正药业)、吉西他滨(法国礼来制药厂)均溶于无血清RPMI 1640培养液中，分别配成1.0μg/ml顺铂、 1μmol/L阿霉素、1.0μg/ml吉西他滨。

1.2 细胞存活率检测 细胞株Hep G2培养于含5%的CO2恒温37 ℃培养箱，分别暴露于既定的化疗药浓度1、2、4、8、12、24、48、72 h。收获的细胞通过四甲基偶氮唑盐(methy thiazolyl tetrazoIium，MTT)方法来检测细胞存活率。具体方法为：用0.25%的胰蛋白酶消化单层人肝癌细胞Hep G2，用无血清RPMI 1640配成单细胞悬液，以每孔1.5×103细胞种植在96孔板培养24 h。然后不同化疗药物处理1、2、4、8、12、24、48、72 h。在既定时间点每孔加入20 μl (0.5 mg/ml) MTT,37 ℃继续培养4 h，然后去除MTT。加150 μl DMSO，振荡10 min。选取490 nm波长在酶联免疫检测仪上检测各孔光吸收值。实验同时以不加药物的无血清培养液为对照组，不加细胞只加无血清培养液为空白对照孔。以空白对照孔调零进行光吸收值测定，细胞存活率计算利用以下公式：细胞存活率=试验组光吸收值(A)/对照组光吸收值(A)×100%。

1.3 Western Blot检测 对于总蛋白提取，细胞悬浮于Western及IP细胞裂解液[20 mM Tris(pH 7.5)，150 mM NaCl，1% Triton X-100，以及sodium pyrophosphate，β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin(购于Beyotime公司)。在4 ℃条件下14 000 r/min离心,共10 min。蛋白质提取后，在做Western-blot实验前，首先要对提取的蛋白质进行定量。将所提取的蛋白质样品取2 μl，加在超微量紫外分光光度仪上，即可直接测定蛋白质浓度，及260/280值。Western Blot实验步骤简述如下(1)上样：用电泳缓冲液冲洗预制胶的孔道，保证每个泳道蛋白上样量均为50 μg。(2)电泳。恒压120 V，密切观察标记条带的位置，待survivin大约处于分离胶中下部时，停止电泳。(3)转膜。电压100 V转膜90 min。在冰桶内转膜，用冰块覆盖。(4)封闭。加封闭液，室温摇床封闭30 min。(5)加一抗。加survivin、GAPDH一抗，4 ℃过夜。(6)加二抗。羊抗兔IgG 1∶2000，室温下摇床孵育1 h。(7)扫膜。使用美国BIO-RAD凝胶呈像仪扫膜，保存图像并用仪器自带分析系统对目的蛋白条带进行吸光度定量分析。

2 结 果

2.1 肝癌细胞株Hep G2对不同化疗药物的敏感性 在药物处理12 h内凋亡细胞的百分比并无明显改变。在顺铂、阿霉素和吉西他滨处理24 h后，肝癌细胞部分凋亡。暴露于这三种药物48 h后细胞存活率显著下降(均P<0.05)。培养72 h后，在顺铂、阿霉素处理组均有20%的肝癌细胞存活并具有代谢活性，吉西他滨处理组仍有>10%的肝癌细胞存活(图1)。

图1 顺铂、阿霉素、吉西他滨处理Hep G2细胞后细胞生存曲线

2.2 顺铂、阿霉素、吉西他滨处理后survivin 蛋白表达水平的变化 1 μmol/L阿霉素，1 μg/ml顺铂和1.0 μg/ml吉西他滨干预24 h， survivin蛋白表达并未见明显变化,差异无统计学意义。1 μg/ml顺铂和1.0 μg/ml吉西他滨治疗48、72 h后survivin 蛋白表达水平明显高于未处理组,差异有统计学意义(P<0.05，表1)。但是,1 μmol/L阿霉素治疗后，survivin蛋白表达并未见明显升高(1.73±0.11vs1.52±0.02；1.66±0.12vs1.52±0.02)，差异无统计学意义(图2) 。

药物survivin蛋白未处理组24h48h72h阿霉素1.52±0.021.61±0.051.73±0.111.66±0.12吉西他滨1.55±0.041.71±0.121.92±0.05①1.88±0.11①顺铂1.25±0.051.41±0.322.04±0.05①1.84±0.02①

注：与阿霉素相比，①P<0.05

3 讨 论

survivin是凋亡抑制蛋白家族的成员，也是迄今发现最强的凋亡抑制因子[2]，于1997年由耶鲁大学Alfieri等用效应细胞蛋白酶受体1(effector-cell protease receptor 1, ERP-1)在人类基因库的杂交中分离获得。survivin可以特异地与细胞凋亡蛋白caspase相结合，从而抑制细胞凋亡[3]。survivin在多种癌组织中高表达，并且对不良预后有一定的预测意义[4,5]。

图2 阿霉素、吉西他滨、顺铂处理后survivin 蛋白水平的变化

本研究发现，肝癌细胞在1.0 μg/ml浓度顺铂、 1 μmol/L阿霉素及1.0 μg/ml吉西他滨处理后的survivin基因与蛋白的变化，表明不同药物处理后凋亡细胞数量在处理12 h内并无明显改变，但在12～24 h，数量迅速增加。在培养72 h后，10%～20%的肝癌细胞仍然存活并具有代谢活性，表明延长这些药物的暴露时间仍然不能彻底消除这些肿瘤细胞。逃脱凋亡的细胞可能对化疗药物敏感性降低。这与Portugal等[6]的研究结果一致，说明化疗药物通过诱发肿瘤细胞发生凋亡从而抑制肿瘤细胞生长并不能消除全部肿瘤细胞。

本研究通过观察不同化疗药物处理肝癌细胞株Hep G2，逃脱凋亡的细胞中survivin的表达变化，发现顺铂和吉西他滨处理48 h后survivin 蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。表明暴露于顺铂和吉西他滨，肝癌细胞Hep G2通过高表达survivin以抵抗药物的杀伤作用，从而降低化疗药物的敏感性。在胃癌中survivin的高表达抑制胃癌细胞的凋亡[7]。黄涛等[8]发现，survivin 蛋白在人肝癌多药耐药(MDR)细胞株Bel-7402/5-Fu中高表达。这些均与本研究结果一致。另外，有研究通过抑制survivin基因表达，发现能更好地抑制卵巢癌耐药细胞株A2780-cp的生长,降低其耐药性,促进其凋亡[9]，更加说明survivin抑制凋亡在化疗药物敏感性中具有重要的作用。

最近， LIU等[10]和李国权等[11]发现，通过siRNA抑制survivin基因的表达能够提高对肺腺癌和HeLa细胞细胞化疗药及γ射线的敏感性,增加细胞凋亡，进一步说明survivin与化疗药物敏感性相关。本研究结果可为肝癌细胞化疗药物敏感性机制探讨提供新的信息。

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[6] Portugal J, Bataller M, Mansilla S.etal. Cell death pathways in response to antitumor therapy [J]. Tumori，2009，95(4):409-421.

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[9] 黄佳佳,吴兴龙,郑 洪.RNAi双向沉默survivin和XIAP基因对卵巢癌细胞A2780-cp凋亡及顺铂敏感性影响的观察 [J].中华肿瘤防治杂志，2011，18(10)：769-771.

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(2014-12-10收稿 2015-03-10修回)

(责任编辑 郭 青)

Relationship between changes of survivin expression and chemotherapeutic sensitivity in Hep G2

LIANG Rui1, MENG Hontao2, DUAN Wei2, WANG Jialin1, LI Zhanning2, and XU Wenhuan3.

1.Department of Hepatobiliary Chest Surgery, 2. Medical Service，Shaannxi Provincial Corps Horspital, Chinese People’s Armed Police Forces, Xi’an 710054, China;3.Scientific Research Office, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China

Objective To investigate the relationship between survivin and chemotherapeutic sensitivity in hepatocellular carcinoma cells. Methods By the method of MTT, the sensitivity of Hep G2was tested to be 1.0 μg/ml cisplatin, 1 μmol/L doxorubicin and 1.0 μg/ml gemcitabine. Western blot was used to detect the expression of survivin protein at various time points after the drugs intervention. Results Cultured for 72 hours, 10-20% of Hep G2cells were still alive(2.039±0.05vs1.258±0.05；1.843±0.02vs1.258±0.05；1.924±0.05vs1.551±0.04；1.884±0.11vs1.551±0.04) ,P<0.05. After cisplatin and gemcitabine intervention for 48 hours, the expression of survivin was elevated (P<0.05). After adriamycin treatment for 48 hours, the expression of survivin protein had no significant change(1.729±0.11vs1.518±0.02；1.667±0.12vs1.518±0.02). Conclusions In Hep G2, the high expression of survivin is associated with the chemosensitivities of parts of drugs.

hepatoma; survivin; cisplatin; gemcitabine; doxorubicin

梁 瑞，硕士，主治医师，E-mail:79669428@qq.com

710061 西安，武警陕西总队医院:1.肝胆胸外科，2.医务处；3.100853 北京，解放军总医院科研处

徐文焕，E-mail:xuwenhuan999@126.com

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