UPLC法测定人工蛹虫草中腺苷和虫草素含量

逄世峰，闫梅霞，崔丽丽，李亚丽，郭靖※，杨珺

(1．中国农业科学院特产研究所，长春 130112； 2．长春市公安局司法鉴定中心，长春 130122)

蛹虫草[Cordycepsmilitaris(L.ex Fr.)Link]是虫草属的模式种，在生物分类学上与冬虫夏草(Cordycepssinensis)同为虫草属[1]，由于天然冬虫夏草的资源非常有限，作为冬虫夏草代替品的蛹虫草已被越来越多的人接受[2]。

虫草素和腺苷是虫草的主要活性成分，虫草素具有抑菌、抗肿瘤、抗病毒、免疫调节、清除自由基等多种生物活性[3]，腺苷具有改善心脑血液循环、抑制中枢神经递质释放等多种活性[4]。超高效液相色谱(UPLC)仪为目前被证实最高效的分离仪器，具有分离时间短、灵敏度高等特点[5]，目前，尚未见在腺苷和虫草素分析方面的应用。本试验建立一种蛹虫草中腺苷和虫草素含量测定方法，旨在为蛹虫草质量控制提供参考依据。

1 材料

1.1 主要材料、仪器和试剂

蛹虫草子实体(中国农业科学院特产研究所新药创制研究室培养)；超高效液相色谱仪ACQUITY(Waters公司)；腺苷标准品(四川维克奇生物科技有限公司)；虫草素(广州宽林科技有限公司)；甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水。

1.2 色谱条件

ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1mm×50mm，1.8μm)；流动相：甲醇-水(15∶85)；流速：0.3mL/min；检测波长：260nm；柱温：35℃；进样量：2μL。

1.3 对照品溶液制备

精密称取腺苷对照品5.61mg、虫草素对照品1.72mg，分别置100mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀即得。

1.4 样品溶液制备[6]

蛹虫草子实体自然晾干至恒重，取出，粉碎，过60目筛，将过筛后的粉末放入自封袋中并置于干燥器中保存。准确称取样品粉末0.1g于50mL离心管中，精密移取25mL超纯水，密封，超声(功率500W、频率40kHz)提取2h，10 000r/min离心10min，取上清，过0.2μm微孔滤膜，供UPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 提取方法的选择

腺苷和虫草素常用的提取方法有加热回流提取法和超声提取法，为防止腺苷高温不稳定[6]，本研究采用了超声提取方法。

腺苷和虫草素常用的提取溶剂有水和甲醇[4，7]，本研究考察了这2种溶剂对蛹虫草中腺苷和虫草素的提取效果，结果表明，水提取腺苷效果优于甲醇，而甲醇提取虫草素效果略优于水(表1)。

表1不同提取溶剂对蛹虫草中腺苷、虫草素含量的影响

Table1EffectsofsolventsonextractionofadenosineandcordycepinfromculturedC.militaris(mg/g)

提取溶剂Extractionsolvent腺 苷Adenosine虫草素Cordycepin水 Water1.1550.336甲醇 Methanol0.2440.345

2.2 样品溶解溶液的选择

本研究考察了标准品水溶液和甲醇溶液对色谱分离的影响。结果发现，当标准品用甲醇溶解时，峰较宽，且圆角；水溶解时，峰形尖锐，色谱分离效果较好。

2.3 色谱柱的选择

本研究比较了ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×50mm，1.7μm)和ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1mm×50mm，1.8μm)。结果表明，ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱对腺苷和虫草素保留较强，更利于腺苷和虫草素的分离。

2.4 流动相的选择

《中国药典》中采用磷酸盐缓冲溶液和甲醇作为色谱分离流动相[7]，本研究考察了甲醇-水、乙腈-水洗脱系统对色谱分离的影响发现，不用缓冲盐依然能得到较好的分离效果，乙腈-水洗脱系统中腺苷稍微拖尾，15%甲醇-水作为流动相时，色谱峰对称，峰形较好。

2.5 线性关系与检出限、定量限

取对照品溶液，分别进样不同体积，以进样质量(ng)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，检出限(LOD)和定量限(LOQ)由3倍和10倍信噪比计算而来，结果见表2。

表2线性回归方程与LOD、LOQ

Table 2 Linear regression data,LOD and LOQ

2.6 精密度试验

取混合对照品溶液，按“1.2”项下色谱条件连续测定6次，记录峰面积。结果腺苷、虫草素峰面积的RSD分别为0.49%和0.54%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0h、4h、8h、12h、16h进样，测定腺苷、虫草素的峰面积。结果腺苷、虫草素峰面积的RSD分别为1.7%和2.3%，表明溶液在16h内稳定。

2.8 加样回收率

精密称定已知含量的蛹虫草粉末6份，置离心管中，添加对照品溶液1mL，精密移取24mL超纯水，按“1.4”项下方法制备样品溶液，在上述色谱条件下测定，结果见表3。

表3加样回收率

Table 3 Recovery of sample (n=6)

2.9 样品测定

按照“1.4”项下方法制备样品溶液，按照“1.2”项下色谱条件测定样品，得蛹虫草子实体中腺苷和虫草素含量为1.22mg/g和0.28mg/g，色谱图见图1。

1.腺苷；2.虫草素 1.Adenosine;2.Cordycepin

3 结论

超高效液相色谱是一个新兴的领域，目前尚未见在腺苷和虫草素分析中应用，本试验建立了蛹虫草子实体中腺苷和虫草素含量的UPLC检测方法。与传统方法相比较，流动相中无需添加缓冲盐，且在1.7min完成测定，该方法简便、快捷，可用于蛹虫草中腺苷和虫草素的含量测定及质量控制。

[1]张姝,张永杰,SHRESTHA Bhushan,等.冬虫夏草菌和蛹虫草菌的研究现状、问题及展望[J].菌物学报,2013,32(4):577.

[2]桂仲争,朱雅红.蛹虫草的人工培育、有效成分及药理作用研究进展[J].蚕业科学,2008,34(1):178.

[3]杨涛,董彩虹.虫草素的研究开发现状与思考[J].菌物学报,2011,30(2):180.

[4]毛新亮,郑国栋,张晨,等.反相高效液相色谱法同时测定冬虫夏草中腺苷、虫草素、肌苷含量方法的研究[J].中南药学,2009,7(12):895.

[5]金高娃,章飞芳,薛兴亚.超高效液相色谱在复杂体系中药分离分析中的应用[J].世界科学技术,2006,8(3):106-110.

[6]郭澄,朱杰,张纯,等.高效液相色谱法测定人工虫草菌丝中腺苷和虫草素的含量[J].中国中药杂志,1998,23(4):236.

[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典[K].北京:化学工业出版社,2010:106.