水稻花药培养技术及其育种应用的研究进展

吴 丹，姚栋萍，李莺歌，吴 俊，伍富根，邓启云,3

（1. 湖南农业大学农学院，湖南 长沙410128 ； 2. 杂交水稻国家重点实验室，湖南 长沙410125；3.中南大学研究生院隆平分院，湖南 长沙410125）

水稻（Oryza sativa L.）是重要的粮食作物之一，中国是世界上最大的水稻生产国。水稻的矮化育种和杂交水稻育种，实现了中国水稻单产的两次跨越式发展。目前,我国正在酝酿着水稻育种的第三次飞跃，即以水稻亚种间杂种优势利用为主的超级稻育种[1]。但是籼粳亚种间杂交后代，存在结实率低、性状不易稳定和疯狂分离等问题。花药培养（花培）又叫单倍体培养，是用处于特定时期的花药经人工离体培养，使花药中的花粉粒单性发育成单倍体植株的过程。单倍体植株经过自然或人工处理，染色体加倍形成纯二倍体，后代性状稳定。与常规育种方法相比，花药培养技术有着可缩短育种年限、后代遗传变异类型丰富、选择效率高等优点[2]。近年来，花药培养技术在水稻育种中被广泛研究。笔者从影响水稻花药培养的因素、存在的问题以及下一步的研究方向等方面进行探讨，以期为花药培养实践提供理论参考。

1 水稻花药培养研究的回顾

日本学者新关宏夫于1968年用花药离体培养首次得到了花培植株，开启了花药培养研究的先河[3]。我国水稻花药培养的研究开始于1970年，1975年首次利用花培技术育成了粳稻新品种单丰1 号。之后研究者们纷纷开展提高水稻花培效率的相关研究，并将花药培养技术与育种相结合[4]，在选育新品种，创新原始材料，不育系、恢复系的选育与提纯方面，都取得了一定的成效。通过花药培养相继育成了一系列性状优良的品种，如中国农业科学院选育的中花系列品种、黑龙江省农业科学院选育的龙粳系列品种、天津市农作物研究所选育的花育系列品种等[5]。目前，通过花培选育的常规水稻品种已有近40个。

亚洲栽培稻包括籼稻和粳稻两大亚型。粳稻相对来讲较易诱导，其花药培养在育种中已取得良好的效果[6]。而籼型水稻，由于出愈率较低，有些材料甚至难以诱导出愈伤组织[7]，其花粉培养的株产率平均只有1%～3%[8]，所以花药培养技术在籼稻育种中的应用还十分有限。目前，通过花培选育的籼稻品种还比较少，至20 世纪末仅有5个，且推广面积都不大。突破籼稻花药培养技术难点，加快籼稻花培在育种中的应用是当前水稻花培亟待解决的难题。

2 影响水稻花药培养力的因素

2.1 基因型

供体品种的基因型是影响水稻花药培养最关键的因素，不同基因型的水稻品种，其花药培养力存在明显差异。沈锦骅等[9]对比分析了各种类型的水稻材料之后，得出各类型水稻的花药培养力由强到弱依次为糯稻＞粳稻＞籼粳型杂交稻＞籼稻，但不同材料之间差异较大。陈兆贵等[10]的研究表明，花药培养力是受亲本控制的遗传性状，如果父本和母本的培养力均较强，F1 代的培养力也会较强。并且有研究显示，愈伤组织的诱导和绿苗的分化之间相关性显著，且均是由多基因控制的数量性状[11]。其中，影响花药培养力的基因被认为在1 号染色体上，而控制绿苗与白苗分化比例的基因位于10 号染色体上[12]。何平等[13]对110个DH 系进行花药培养力的数量性状位点（QTLs）分析，得到了与愈伤组织诱导有关的5个QTLs，分别分布在第6、7、8、10 和12 号染色体上，与绿苗分化率有关的2个QTLs 分布在1 号和9 号染色体上。研究认为，如果将能提高愈伤诱导率和绿苗分化率的QTLs聚合在一起，筛选出愈伤诱导率和绿苗分化率均较高的材料，将大幅度提升花药的培养力。

2.2 取材与预处理

单核靠边期是水稻花药培养的最佳时期。花药过老或过嫩，都会影响愈伤的诱导率。田间取样的最佳时间一般为晴天的上午8︰00～10︰00 或下午16︰00～18︰00，此时细胞处于旺盛的分裂期。在试验过程中，可通过某些器官的形态特征来判断花药的发育时期。通常，花药的单核靠边期，穗子苞大而不破，颖壳浅绿色，花药淡黄色，花药长度伸长至颖壳2/5～1/2处，剑叶与下一叶的叶枕距为5～10 cm[14]。但这种形态判断指标比较粗放，不同的材料间存在较大差异，故不同的材料取材时要综合衡量。

低温预处理是提高花培效率最常规有效的手段，可使水稻愈伤组织诱导率提高几倍至几十倍。低温处理的作用机制是延缓花粉的退化、维持花粉发育的生理环境、提高内源生长素水平、降低乙烯含量、启动雄核发育等。张跃非等[15]认为低温预处理的最适温度为8℃，时间以8 d 为宜。目前4℃处理7 d，或7～8℃处理8～10 d，都可获得较好的效果。但最佳处理温度和时间因材料而异，一般来说较低的处理温度需要较短的放置时间，较高的处理温度需要较长的放置时间。

2.3 培养基

2.3.1 培养基的种类与成分 培养基的类型也是影响水稻花培效率的重要因素之一。不同的试验材料，适用的培养基不一样。目前，还没有一种万能的培养基能适用于各种不同类型水稻材料的花药培养。培养基中氨态氮与硝态氮的比例及氨离子的用量对花培的影响较大，籼稻氨离子以3.5 mmol/L 效果较佳，粳稻的则为7 mmol/L，籼粳交杂种的介于两者之间。镁离子的用量，对花培效率也有一定影响。朱至清等[16]的研究表明，镁离子以2.2 mg/L 较好，不仅有利于愈伤组织的诱导，还有利于绿苗的分化。适宜的铁离子浓度，也能够提高花药培养力。过垒生等[17]的研究表明，铁离子的用量与2,4-D 的浓度有关。研究者为了得到最佳的培养效果，通过改变培养基中各组分的用量，设计了多种培养基。其中，N6 培养基适用于粳稻的花培，合5 培养基适用于籼稻[18]，改良的M 8、SK3培养基则对籼粳杂种有较好诱导效果[19]。冯双华等[20]的研究表明，改良的M 8 培养基对基因型不同的材料有较广泛的适应性。培养基的各种组分相互作用相互影响，如果要通过逐个试验去找到每个元素的最佳用量，不仅工作量大，而且成效不一定显著，因此在筛选培养基种类时抓住主次显得尤为重要。

2.3.2 激素配比 花药离体培养过程中，生长调节物质的用量和配比对愈伤组织的诱导和绿苗的分化都至关重要。有研究表明，在只含2,4-D 的诱导培养基上，愈伤组织比较松软，呈黏液化，较难分化。而在诱导培养基上添加NAA 和KT，可以改善愈伤组织质量，提高愈伤组织的诱导率[21]。复合激素能显著提高水稻花药培养力，不同材料的最适激素种类及配比差异较大。冯双华等在籼型水稻材料中，添加1.5 mg/L的2,4-D 和NAA 取得了较好的诱导效果。在培养基中添加KT 可以提高愈伤的诱导率，但是提高诱导率的同时也增加了白苗率。总体来说，籼稻所需要的激素含量更高，激素种类和配比因材料而异。

2.3.3 碳源与其他添加剂 碳源不仅提供能量，而且是培养基渗透环境的主要调节物质。糖类是主要的碳源，蔗糖被认为是植物组织培养的标准碳源，一般认为3%～6%的蔗糖为水稻花药培养的常规用量。孙宗修等研究发现在麦芽糖为碳源的培养基上，愈伤组织平均诱导率显著高于以蔗糖为碳源的培养基。麦芽糖并不是适用于所有基因型的水稻材料，有些材料在麦芽糖为碳源的培养基上诱导出的愈伤组织质量较差。另外，也有用砂糖做碳源取得较好诱导效果的研究报道。但可能是砂糖纯度低，除了提供能量和渗透压外，还补充了一些微量元素，从而提高了花药的培养力。其他一些添加剂对于提高花药培养力也有一定效果。在培养基中添加脯氨酸、水解酪蛋白、山梨醇等营养物质，可以缓解愈伤长势不好的状况[22]。添加山梨醇可明显改善愈伤组织生长状况，提高其再分化能力；活性炭是最常用的添加剂，有研究表明，活性炭可以提高烟草花培的出苗率[23]。丁元丰等[24]认为活性炭对苗高、根长、根数和鲜重均有显著促增作用。还有报道称，锗能够降低白苗率，多效唑能明显提高绿苗分化率和壮苗等[25]。冯英等[26]研究发现，添加1 mg/L 的烯效唑（S-3307）能促进愈伤组织的诱导率和绿苗分化率。

3 水稻花培亟需解决的问题及对策

3.1 基因型的影响

基因型是影响水稻花药培养力最关键的因素。籼稻花药培养力很低，阻碍了其在育种上的应用。要提高籼稻的花药培养力，最根本的办法是通过杂交等遗传改良手段，把高培养力基因导入到优良亲本或杂种中，通过改变基因型，来提高材料的花药离体培养能力。但要通过这种办法同时得到农艺性状良好，花药培养力高的材料还存在一定困难。目前，常用的方法是从已有的优良性状材料中，筛选出花药培养力高的材料进行花培。一般而言，粳稻花药培养力大于籼稻，在育种中常以粳稻作为桥梁亲本，来提高籼稻花药培养力。但桥梁亲本重复使用，会使遗传血缘日益狭窄。如果以广亲和品种为桥梁亲本，可在一定程度上减轻这一状况。为了解决水稻遗传背景贫乏的问题，可收集大量的野生稻做原始材料，进行广亲和性杂交研究，使花药培养在材料上取得突破，以发挥花培育种的优势。

3.2 褐化

花药的褐化是指花药在培养过程中释放褐色物质，花药逐渐变褐而死亡的现象。花药里面的小孢子发育需要花药提供营养，诱导早期，花药褐化，小孢子将会由于得不到充足的营养而退化，从而影响愈伤组织的诱导形成。褐变发生的条件很复杂，不只是多酚和多酚氧化酶直接作用的结果[27]。引起花药褐化的因素很多，首先取材时期特别关键，单核靠边期是花粉培养的最佳时期，过老的花药在培养过程中更容易引起褐化。另外，光照过强和较高的培养温度均会提高氧化酶的活性，从而促进酚类物质氧化而引起褐化。还有研究表明，降低培养基中无机盐浓度和微量元素锰的含量也可以降低褐化率。

3.3 白化

白化是指离体培养得到的幼苗整株或部分失绿，表现为白色或者黄色，白化植株的产生是禾本科植物花药培养的特征之一。有研究认为，这可能是禾本科植物DNA 共同的特殊性，他们对离体条件十分敏感，易发生缺失或其他变异[28]。空间诱变能改善一些诱变材料的白苗分化率，但综合性状表现仍然较差[29]。陈启伟等[30]认为液体培养基可以提高绿苗率。另外，降低培养基中无机盐浓度和微量元素锰的含量，在不影响正常生长和分化的前提下降低温度，减少光照均可以降低白苗率[31]。在诱导培养基中，添加过量的2,4-D或者KT，可提高愈伤组织的诱导率，但同时也提高了白苗率。因此，在培养过程中愈伤组织要给予充足的营养，减少不当的刺激。目前，白苗现象仍然是一个难以解决的问题。

4 结语

杂交水稻育种从杂种优势利用水平上，分为品种间、亚种间和远缘间杂种优势利用3个阶段。品种间由于亲缘关系较近使得杂种优势弱；亚种间尤其是籼粳间杂种优势更明显，产量潜力大，但采用传统方法来稳定籼粳亚种间杂交后代性状的时耗长、难度大，而花药培养可加快后代性状的稳定速度，缩短育种时间。目前，大部分水稻的花药培养力仍然较低，尤其是籼稻，很难满足育种需求。攻克籼稻出愈率低、愈伤组织易褐化、白化等瓶颈，全面提升水稻花药培养技术是现代育种的迫切要求。基因型是影响花药培养力的关键因素，但培养条件同样重要。基因型方面，可从性状优良的水稻材料中选择花药培养力高的材料进行培养，或通过导入高培养力基因来提高材料的花药培养力。培养条件方面，取材时期、预处理、培养基、激素、添加剂，培养环境等均会影响花药培养力，不同材料的适宜培养条件各异，所以要在前人经验的基础上不断探索，因材料而异地寻找某种或者某类材料的最佳培养条件。在今后研究中，要进一步研究花药离体培养体系和遗传机理等课题，完善花培育种模式，使花药培养技术尤其是籼稻花培技术更加成熟，更好地为水稻育种服务。同时，也要将花药培养与转基因、分子标记等分子生物学技术相结合，加快育种进程，提高育种效率。

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