痒螨抗原研究进展

王保健，朱俊杨，杨光友，钟传德，2，古小彬＊（.四川农业大学动物医学院，四川成都630；2.玉林市动物疫病预防控制中心，广西玉林537000）



痒螨抗原研究进展

王保健1，朱俊杨1，杨光友1，钟传德1，2，古小彬1＊
（1.四川农业大学动物医学院，四川成都611130；2.玉林市动物疫病预防控制中心，广西玉林537000）

摘 要：痒螨病是多种家养及野生动物体表常见的外寄生虫病，对养殖业造成重大经济损失。该病传统的治疗方法有很大的缺陷，因此，有必要采取安全的免疫学方法来控制痒螨病。为了进一步研究痒螨抗原的功能及其特征，论文主要综述了国内外关于痒螨抗原基因的获取、生物信息特性、体外表达及其重组蛋白的免疫功能，为痒螨病的早期诊断和疫苗开发研究提供参考。

关键词：痒螨；抗原；基因

痒螨病是分布于世界各国多种家养动物及野生动物的一种常见外寄生虫病。动物患痒螨病后可造成生产性能及畜产品质量下降，消化吸收机能降低，增加饲养与治疗成本，甚至造成动物个体或群体大批死亡，给养殖业造成了巨大的经济损失，同时威胁野生动物的生存与种群数量的增加［1］。

在痒螨病的诊断方面，目前我国主要通过病原学诊断方法，根据患病动物出现脱毛、消瘦、出现痂皮等临床特征可作初步诊断，然后分离病原显微镜检才能够做出准确的诊断，但这种诊断方法仅适用于痒螨感染后期出现典型的临床症状之后，并不适用于痒螨病的早期诊断［2］。而痒螨抗原的免疫学诊断则能够克服这一缺陷，目前研究者已经初步探究了痒螨的变应原2型和肌钙蛋白C在痒螨病早期诊断方面的作用，诊断敏感性均在90%以上，但存在特异性不高的问题，易与疥螨病形成交叉反应，影响诊断结果。目前，防控痒螨病尚无疫苗可用，主要依靠有机磷、菊酯类和伊维菌素类等化学杀螨剂，但这些药物的长期使用导致了螨虫抗药性、药物残留及环境污染等问题，严重威胁人畜健康［3-4］。因此，迫切需要人们寻找新的方法来防控该病，近年来，随着分子生物学技术的快速发展和免疫学技术的日趋成熟，国内外学者对痒螨抗原的研究进入了一个新的阶段，为痒螨病的早期诊断及相关疫苗的开发奠定了良好的基础。

1　具酶活性抗原

具有酶活性的抗原是痒螨比较重要的一类抗原物质，痒螨寄生后通过摄取宿主营养来完成其生长发育，在此过程中需要各种消化酶的作用。半胱氨酸蛋白酶就是痒螨的一种消化酶，它能够降解宿主的结缔组织，从而有助于痒螨完成其生长发育［5］。此外，在痒螨寄生过程中宿主会产生许多氧自由基等氧化性物质，如果不及时清除会对痒螨的存活有一定影响，谷胱甘肽-S-转移酶和硫氧还蛋白过氧化物酶作为痒螨的抗氧化酶则有助于氧自由基的清除从而有利于痒螨实现免疫逃避［6］。

1.1半胱氨酸蛋白酶

半胱氨酸蛋白酶（cysteine protease，CP）是广泛存在于动植物以及寄生虫中的一类含有半胱氨酸残基的蛋白水解酶，是蛋白酶家族中最重要的成员之一。研究发现，该酶与寄生虫的致病力、对组织和细胞的侵袭力以及免疫逃避等多方面有关［7］。同时该酶也可作为多种寄生虫病诊断抗原、疫苗候选分子及药物靶标［8］。为了探究半胱氨酸蛋白酶在痒螨免疫诊断和免疫预防方面的效果，有学者成功扩增了绵羊痒螨的半胱氨酸蛋白酶基因序列，并对其进行了原核表达［9］。该序列的原核表达产物（rPso o 1）能与绵羊痒螨的阳性血清Ig G和Ig E抗体相识别，提示该抗原可作为绵羊痒螨的诊断抗原，但本文并未开展抗原诊断的特异性和敏感性研究。研究者还以重组蛋白（rPso o 1）作为包被抗原通过ELISA方法评价了绵羊痒螨人工感染后绵羊血清抗体的分泌情况，结果检测到高水平的血清Ig G，但Ig E变化不是很明显。随后，Nisbet等［5］得到绵羊痒螨半胱氨酸蛋白酶基因序列的完整序列，序列长966bp，共编码一段含322个氨基酸序列的多肽，分析发现该氨基酸序列与美洲尘螨（Dermatophagoides farinae）的同源氨基酸序列具有80%的相似性。该基因的真核表达产物（rPso o 1）并不具有酶活性；经免疫组化发现该蛋白分布于痒螨的口腔、肠道上皮及肠道分泌排泄物内。半胱氨酸蛋白酶作为痒螨的一种分泌排泄抗原，在痒螨的免疫诊断和免疫预防方面有重要研究价值，在痒螨感染过程中半胱氨酸蛋白酶可作为分泌/排泄物进入宿主免疫系统，从而诱导宿主的免疫应答反应。

1.2谷胱甘肽S转移酶

谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase，GST）广泛分布于脊椎动物和无脊椎动物体内，是具有解毒功的酶系之一。多年研究证实谷胱甘-S-转移酶具有良好的免疫保护功能，是多种寄生虫疫苗研制的候选抗原之一［10-11］。在痒螨GST的免疫学研究方面，Lee A G等［12］成功构建了绵羊痒螨cDNA文库并从中筛选得到长660bp的谷胱甘肽-S-转移酶（GST）核苷酸序列，共编码一段含220个氨基酸序列的多肽。原核表达后的重组蛋白分子质量为30ku，显示出良好的酶活性。随后，Nisbet A J等［13］通过免疫筛选技术得到绵羊痒螨（P.ovis）的GST序列。原核表达后的重组蛋白（rPoGST）显示出良好的酶活性，将其与佐剂混合后免疫绵羊，2周后收集血清，免疫印迹发现重组蛋白能够特异性识别该血清Ig G，表明重组蛋白具有良好的免疫原性。

1.3硫氧还蛋白过氧化物酶

硫氧还蛋白过氧化物酶（peroxiredoxin，Prx）是新近发现的抗氧化酶系，广泛存在于各种生物体内。寄生虫硫氧还蛋白过氧化物酶作为抗原可以诱导宿主Th1/Th2应答反应、CD4+辅助T、B细胞应答诱导宿主细胞旁路激活路径，可作为多种寄生虫病的诊断和保护性抗原［14］。Mcnair C等［6］从绵羊痒螨的总RNA中扩增得到618bp的硫氧还蛋白过氧化物酶基因，分析发现表达后的重组蛋白氨基酸序列与肩突硬蜱（Ixodes scapularis）硫氧还蛋白过氧化物酶序列相似性达72%。纯化后的重组蛋白显示出良好的酶活性，这可能与痒螨的免疫逃避有关。有研究指出痒螨感染后会诱导机体产生嗜酸性粒细胞、中性粒细胞，巨噬细胞［15］。而这些细胞代谢会产生高度不稳定的活性氧物质（ROC），能够对痒螨造成损伤，但是痒螨不仅能够在有氧条件下生存，而且可以在ROS产生的氧化应激状态下存活并发育成熟，在此过程中Prx作为抗氧化酶发挥着重要作用，能够保护痒螨抵抗来自宿主体内及自身新陈代谢产生的ROS从而逃避宿主的免疫应答。此外，痒螨Prx能够识别绵羊痒螨阳性血清IgG，也提示该抗原可作为绵羊痒螨的免疫诊断抗原。免疫组化发现重组蛋白主要定位于痒螨的口器和胃部。

2　与痒螨运动相关抗原

痒螨寄生后在虫体的机械刺激和毒素作用下，宿主皮肤组织会发生炎性浸润，在皮肤局部形成结节和水疱。随着病程的发展痒螨会在宿主表皮移行，并逐步向周围扩散从而导致病情更加恶化。研究发现原肌球蛋白、副肌球蛋白和肌动蛋白等抗原与寄生虫的发育和运动密切相关，有利于摄取宿主营养［16］。国内外学者已经对痒螨的原肌球蛋白、副肌球蛋白、肌动蛋白和肌钙蛋白C等抗原进行了相关研究。目前这些研究主要集中于对其免疫原性的初步探讨方面，尚未见对其具体生物学功能的研究报道。

2.1原肌球蛋白

原肌球蛋白（Tropomyosin，Tm）由两条平行的多肽链组成，呈α螺旋构型，是细肌丝中与肌动蛋白的结合蛋白，研究发现其与寄生虫的发育和运动有重要的关系，具有较好的免疫原性［17］。Nisbet A等［18］通过RT-PCR方法扩增得到了长852bp的绵羊痒螨（P.ovis）原肌球蛋白基因序列，共编码一段含284个氨基酸序列的多肽，进一步分析发现该氨基酸序列与美洲尘螨（D.farinae）和欧洲尘螨（D. pteronyssinus）原肌球蛋白氨基酸序列相似性分别可达98%和97%。该蛋白分布于痒螨的肌肉组织，这也提示痒螨原肌球蛋白可能与痒螨的运动和摄食相关。免疫印迹发现该重组抗原能够与鼠抗屋尘螨原肌球蛋白血清特异性识别。

2.2副肌球蛋白

副肌球蛋白（paramyosin，PM）是存在于大多数无脊椎动物中的一种α螺旋蛋白质，是多种无脊椎动物肌细胞中粗肌丝的主要成分，在粗肌丝的组装过程中有重要作用。目前，国内外学者已对血吸虫和猪囊尾蚴等寄生虫的副肌球蛋白及其基因进行了大量研究，研究表明副肌球蛋白具有高效的免疫保护性，可作为多种抗寄生虫感染的候选疫苗［19-20］。Nisbet A等［18］从通过绵羊痒螨的总RNA中扩增得到2 625bp副肌球蛋白基因，共编码一段875个氨基酸序列的多肽，分析发现该氨基酸序列与欧洲尘螨（D.pteronyssinus）、疥螨（Sarcoptes scabiei）及热带无爪螨（Blomia tropicalis）的副肌球蛋白氨基酸序列相似性分别可达97%、95%、89%。有报道指出副肌球蛋白在欧洲尘螨和疥螨中体现出良好的免疫学价值，能够诱导宿主产生IgE［21-22］。本研究发现兔痒螨副肌球蛋白在痒螨的肌肉组织中广泛存在，提示该蛋白可能与痒螨的摄食与运动有关。免疫印迹发现该重组蛋白能够识别鼠抗热带无爪螨（B.tropicalis）阳性血清。但论文未做免疫保护等相关研究。

2.3肌动蛋白

肌动蛋白（Actin）是肌细胞和非肌细胞结构的重要组成部分，存在于所有真核细胞中。它参与许多重要的细胞过程，如肌肉收缩、细胞运动、细胞分裂和胞质分裂、囊泡和细胞器的运动、细胞信号传导和建立［23］。Zheng W等［16］经RT-PCR方法得到兔痒螨长1 131bp的序列，经分析发现其与疥螨（S. scabiei）肌动蛋白基因具有89.26%的同源性，免疫印迹发现重组肌动蛋白（rPc-act）能够识别兔痒螨阳性血清，表明该蛋白可用于兔痒螨的免疫诊断。免疫保护试验表明，虽然该重组蛋白能诱导免疫兔产生高水平的特异性IgG，但血清IgE变化并不是很明显，而且与对照组相比该重组蛋白也不能引起兔人工感染痒螨后的感染程度出现明显的变化。说明兔痒螨肌动蛋白并未对兔痒螨的感染形成免疫保护作用。报道还指出痒螨在寄生过程中能够通过摄取宿主的免疫细胞和免疫球蛋白作为其食物来源，从而逃避宿主的免疫系统［6，24］，但这是否会影响兔痒螨肌动蛋白的免疫保护力还有待进一步研究。该蛋白分布于兔痒螨的全身，尤其足部以及肌肉分布较为丰富，这可能与痒螨在宿主体内的移行与摄食有关

2.4肌钙蛋白C

肌钙蛋白（troponin C）是一种调节蛋白，由肌钙蛋白T（TnT）、肌钙蛋白I（TnI）和肌钙蛋白C （TnC）3种亚基组成。TnC是肌钙蛋白中唯一的Ca2+结合受体，参与调节细肌丝的活化过程，与寄生虫的肌肉收缩有密切的关系［25］。Zheng W等［26］通过RT-PCR的方法扩增得到长46 2bp的痒螨肌钙蛋白C基因序列，并对其进行了原核表达。研究者通过Dot-ELISA评价了表达后的重组蛋白在痒螨感染诊断方面的价值，诊断特异性可达97.6% （83/85）。但研究也发现该重组蛋白也能够识别疥螨病阳性血清，存在严重的交叉反应（9/12）。肌钙蛋白虽然可以作为痒螨病的诊断抗原，但如何提高诊断的特异性仍然是亟待解决的课题。

3　痒螨变应原2型

变应原2型（Pso o2）为尘螨中研究较多的一类变应原，研究证实其具有良好的免疫活性［27-28］。近年来，国内外学者们参考尘螨的变应原2型序列对痒螨的同源基因进行了研究。Temeyer K B等［29］通过RT-PCR的方法扩增得到378bp的Pso o2的基因序列。序列分析表明在氨基酸序列的116位（Thr）存在一个潜在的O-糖基化位点，但未对该段序列进行后续研究。随后，Nunn F G等［30］使用ELISA方法评价了Pso o2原核表达蛋白在绵羊痒螨病早期诊断方面的价值。结果发现，重组蛋白（rPso o2）能够识别绵羊痒螨（P.ovis）感染早期的阳性血清IgG，诊断特异性和敏感性分别可达90% 和93%，表明Pso o2可作为绵羊痒螨病的早期诊断抗原。痒螨病的早期诊断有十分重要的意义，因为在痒螨感染的早期并不会表现出明显的临床症状，但是痒螨的寄生会诱导宿主产生抗体和细胞因子，而这种早期诊断抗原能够在疾病感染早期检测到相应抗体，从而达到早期诊断的目的，为痒螨病的防控创造良好的条件。

4　小结与展望

随着对痒螨功能基因研究的不断深入和挖掘，人们发现了越来越多的痒螨抗原基因。但目前对这些抗原基因的研究主要集中在这些抗原的免疫定位与其免疫活性的初步探讨方面，对于痒螨抗原的免疫应答机制的研究与其在免疫保护方面的研究还相对较少。在痒螨诊断抗原的研究方面，虽然免疫学诊断方法的特异性和敏感性都要高于传统诊断方法，但是仍然存在一定的交叉反应。如何进一步筛选得到高特异性的痒螨病诊断抗原仍然是后续研究值得注意的一个课题。此外，在这些抗原的体外表达方面，由于技术条件的限制，现行的原核表达系统的表达产物不能够形成正确的折叠及糖基化修饰，

从而导致表达产物免疫原性降低。因此，如何提高体外表达蛋白的免疫原性及其生物学活性是亟待解决的问题；另外，通过有效的试验技术方法来揭示螨类功能基因的生物学功能及相关免疫应答方面的探究，将会是螨类疫苗研制的下一个重要课题。有理由相信，随着分子生物学和生物信息学技术的不断完善，尤其是基因组学和蛋白质组学研究的不断深入，螨类疫苗的研究必定会产生质的飞跃。

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Advance in Antigen of Psoroptes Mites

WANG Bao-jian1，ZHU Jun-yang1，YANG Guang-you1，ZHONG Chuan-de1，2，GU Xiao-bin1
（1.College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Chengdu，Sichuan，611130，China；2.Animal Disease Control Center of Yulin，Yulin，Guangxi，537000，China）

Abstract：Psoroptic acariasis is a common worldwide ectoparasitosis，which occurs in domestic and wild animals worldwide.It can cause considerable economic losses in breeding industry.However，the conventional treatment for this disease has a great disadvantage.Therefore，it is necessary to take some safe immunological methods to control it.To further investigate the function and characteristics of Psoroptes mite antigens，this review outlined the acquisition of Psoroptes mite antigen genes，their bioinformatics features，expression in vitro as well as immunological function of the recombinant proteins.This might provide useful information to develop early diagnosis and an effective vaccine against psoroptic acariasis.

Key words：Psoroptes mite；antigen；gene

作者简介：王保健（1990-），男，湖北随州人，硕士，主要从事动物寄生虫病学研究。＊通讯作者

基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（31402188）；四川省教育厅项目（14ZB0003）

收稿日期：2015-01-12

中图分类号：S852.746

文献标识码：A

文章编号：1007-5038（2015）07-0099-05