CpG ODN免疫佐剂效应研究进展

摘 要：人工合成的含非甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸（CpG ODN）能够与树突状细胞、B细胞、单核细胞及巨噬细胞等免疫细胞内质网膜上的Toll样受体9（TLR－9）结合，通过产生Th1型免疫反应和分泌促炎因子来增强免疫应答的强度，在机体抵抗病原入侵和抗肿瘤等方面起到免疫增强剂的作用。近年来，CpG ODN作为一种新型免疫佐剂受到了人们越来越多的关注。论文主要介绍了CpG ODN的种类及其结构和功能特征、作用机制、对畜禽的免疫增强作用、安全性等方面的研究进展，为CpG ODN作为疫苗佐剂的进一步研究和在兽医临床上的应用提供参考。

文献标识码：A

文章编号：1007－5038（2015）10－0105－05

收稿日期：2015－04－19

基金项目：吉林省科技发展计划项目（20130522088JH，20140307008NY）

作者简介：董 鹏（1990－），男，吉林通化人，硕士，主要从事动物病毒学研究。＊通讯作者

CpG寡核苷酸（oligodeoxynucleotides containing CpG motifs，CpG ODN）是人工合成的含非甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸，直链型，长度通常为十几至二十几个碱基不等。CpG ODN能够模拟细菌DNA的免疫刺激活性，作为一种病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMP）与动物机体许多免疫细胞中的模式识别受体（pattern recognition receptors，PRR）TLR－9结合，刺激机体产生固有免疫应答，有效增强树突状细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞等免疫细胞的活性和促进多种细胞因子的分泌 ［1］，从而非特异性的增强适应性免疫应答的强度，在机体抵抗病原入侵和抗肿瘤等方面起到免疫增强剂的作用。因此，CpG ODN可作为疫苗佐剂来提高疫苗的免疫效果，并且其突破了传统佐剂主要是仓储、缓释的作用机理，具有很大的开发和应用前景。研究发现，CpG ODN作为一种新型疫苗佐剂，既可以单独使用也可与氢氧化铝佐剂联合使用发挥协同作用，具有用量低、作用强、副作用小，应用范围广等优点。目前CpG ODN作为乙型肝炎疫苗佐剂已进入Ⅲ期临床试验阶段 ［2］。而CpG ODN作为兽用疫苗佐剂的应用，仍处于实验室研究阶段。

1 CpG ODN的发现

机体的免疫功能可分为固有免疫和适应性免疫两部分。其中固有免疫是机体抵抗病原入侵的第一道防线，它包括皮肤、黏膜的天然屏障作用，巨噬细胞、中性粒细胞的吞噬功能和补体系统的功能等。除了这些，机体还能够通过识别病原在进化上相对保守的分子结构即PAMP，产生某些具有免疫增效作用的细胞因子来提高自身对抗病原的能力。这就提示我们可以利用固有免疫的这一机制在人工主动免疫时有针对性的增强机体免疫应答的强度。识别病原相关分子模式的PRR，包括Toll样受体、Nod样受体、RIG－I样受体等，其中Toll样受体是人们广泛研究的一类模式识别受体。Toll样受体受到刺激以后所产生的固有免疫应答主要表现为产生促炎因子、趋化因子、Ⅰ类干扰素和抗菌肽等 ［3］。

从20世纪80年代开始，人们陆续发现，细菌、病毒和无脊椎动物的DNA中，广泛存在着非甲基化的CpG二核苷酸片段，这样结构的病原相关分子模式，其配体是TLR－9，可以激活固有免疫系统。随着人工合成寡聚脱氧核苷酸研究的深入，人们发现CpG ODN能够模拟天然CpG DNA的免疫刺激活性，在被树突状细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞等靶细胞内化之后，会在内质网膜上的晚期内吞溶酶体区室中与TLR－9结合 ［4］，有效增强相应细胞的活性和促进多种细胞因子的分泌，诱导Th1型免疫应答 ［1］，在机体抵抗病原入侵和抗肿瘤等方面发挥免疫增强剂的作用。CpG ODN在功能上具有非特异性免疫增效作用，而本身作为人工合成的寡核苷酸又比较容易获得，从而使其具备了成为一种可应用的高效疫苗佐剂的潜力而受到人们的广泛关注，是目前新型疫苗佐剂研发的一个重要方向。

2 CpG ODN的种类、结构和功能特征

目前，根据结构和生物学特性，CpG ODN可分为A、B、C、P四种类型。A型CpG也称D型CpG，特点是在一个以CpG为核心的六核苷酸即CpG基序的两侧均有回文序列，且在3′和5′末端有poly G尾，其两侧poly G所属核酸骨架进行硫代修饰，中间的活性部分则不进行硫代修饰。A型CpG的长度通常为20个～21个碱基，例如CpG2216的序列为5′－GGGGGACGATCGTCGGGGGG－3′。A 型CpG能够刺激浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells，pDC）成熟和分泌IFN－α，诱导自然杀伤细胞产生IFN－γ并诱导单核细胞分化成树突状细胞，但不能活化B细胞 ［5］。

B型CpG也称K型CpG，是在全硫代修饰的骨架中包含多个CpG基序，例如CpG2006的序列为5′－TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT－3′。硫代修饰的核酸相比于天然核酸提高了其抵抗核酸酶消化的能力，能够大幅延长其在体内的半衰期，有利于更好的发挥生物学作用，这也是人工合成的CpG ODN相比于天然CpG DNA的优势之一。B 型CpG不能诱导pDC产生IFN－α，但能触发pDC产生共刺激信号分子和TNF－α，诱导B细胞增殖和IgM的产生，同时上调活化标记、诱导B细胞和单核细胞分泌IL－6 ［5］。

由于A型和B型CpG的结构不同，使得它们在胞内存在的形式不一样，也就导致了不同的生物学活性。A型CpG由于poly G的存在会形成大分子聚合物，它与TLR－9所形成的复合物会在pDC的早期核内体中存留较长时间。在早期核内体中，A型CpG与MyD88／IRF－7复合物相互作用，触发信号级联反应，促使pDC产生IFN－α ［6］。B型CpG主要以单体形式存在，同样情况下会迅速通过早期核内体而进入晚期核内体，不能诱导pDC产生IFN－α。

C型CpG和B型CpG一样，具有全硫代修饰骨架，同时又像A型CpG那样在CpG基序两侧带有回文序列，例如CpG2395的序列为5′－TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG－3′。此类CpG能够刺激B细胞产生IL－6和pDC分泌IFN－α ［7］。C型CpG存在于早期和晚期核内体中，因此性能兼有A型和B型CpG的特点。

最近还发现了一种新类型的CpG，即P型CpG。P型CpG两端包含较长的回文序列，使其能够形成更高的有序结构，例如，5′－TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG－3′。P型CpG能够刺激pDC和B细胞，诱导产生相对于C 型CpG更高水平的IFN－α ［8］。

3 CpG ODN免疫佐剂效应的作用机制

3．1 胞内信号通路和对基因表达的影响

CpG ODN与TLR－9结合后所引发的信号级联反应能够使调节参与炎症反应的基因活化。这一信号通路是通过刺激信号分子MyD88、IRAK和TRAF－6逐级实现的，在信号传递到TRAF－6之后，细胞会产生TAK1等各种蛋白激酶，并通过MAPK途径活化转录因子NF－κB、AP－1和IRF－7，促进促炎基因的表达 ［9］。

研究表明，CpG ODN作用于机体的30min之内便可以检测到TNF、IL－1β和IL－1α的基因表达的变化，3h之后基因的活化达到第一个高峰，这期间有近1 000个基因表达上调 ［10］。这些基因包括参与免疫反应的功能型基因，如编码IL－1α、IL－1β、TLR－9和TNF的基因；参与细胞间信号传导的基因，如编码NFKB1A、MyD88、IRAK－M和A20的基因；参与细胞运动的基因，如编码BFL－1，NAP－1，NAK和EGFR的基因 ［11］。基因表达水平在3d之后下降一段时间，然后在第5天再次上升达到第二高峰。基因活化的第二高峰中主要激活的基因包括细胞周期调控基因，如编码PLK1、WEE1、CHK2 和TOPO2A的基因及DNA损伤修复基因，如编码BRCA1、GADD4A、E2F4和RPA1的基因 ［11］。

3．2 对免疫细胞活性的影响

CpG ODN通过与TLR－9结合，直接激活浆细胞样树突状细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞，诱导固有免疫和适应性免疫应答的产生。CpG ODN刺激pDC的特点是上调CD40、CD80、CD86和 MHC－Ⅱ类分子的表达 ［12］，增加IL－1、IL－6、IL－12、IL－18和TNF－α的产量 ［9］，抵抗IL－4诱发的细胞凋亡，并促进pDC成熟，提高其处理和抗原递呈的能力。与此同时，CpG ODN也能刺激pDC产生广泛限制病毒和细菌生长的I型IFN ［13］。

CpG ODN刺激B细胞后会促使其产生IL－6、IL－12和结合于CXCR3的趋化因子IP－10、Mig和I －TAC，并分泌IgM ［14］。其中IL－6的表达也能够促进B细胞本身IgM的分泌。CpG ODN通过上调B细胞的Fc受体和共刺激分子包括MHC－Ⅱ类分子、CD40、CD80和CD86来激活B细胞 ［15］。随后受到CpG刺激的B细胞增殖并分化为浆细胞和记忆B细胞。CpG ODN通过单独激活TLR－9就足以促使记忆性B细胞产生抗体，而初始B细胞则需要BCR的共刺激作用 ［16］。值得注意的是，CpG ODN刺激CD5 ＋B细胞分泌大量IL－10，这抑制了树突状细胞分泌IL－12，从而抑制了Th1型免疫反应 ［17］，使受CpG ODN刺激后的机体不至于反应得太强烈，这类似于一种负反馈调节。

CpG ODN刺激单核细胞后，会提高其分泌IL－6、IL－12和TNF－α等细胞因子的水平，增加MHC－Ⅱ类分子、共刺激信号CD40、CD86的表达，提高单核细胞的抗原递呈功能，并能延长细胞存活的时间 ［18］。CpG ODN激活巨噬细胞，能够使其分泌IL－ 6、IL－12、IL－18、IL－1P、TNF－α等多种细胞因子，上调多种趋化因子和共刺激分子的表达 ［19］。

CpG ODN可间接促进NK细胞和T细胞的功能。pDC受到CpG ODN刺激后，IFN－α的分泌量增加，从而增强NK细胞的活性。CpG ODN对NK细胞的活化还依赖于巨噬细胞的协同作用，即CpG ODN刺激巨噬细胞分泌的IL－12等细胞因子能够促使NK细胞产生IFN－γ。而IFN－γ能够促进Th1型细胞的成熟，从而使CpG ODN表现出间接活化T细胞的功能。

4 CpG ODN对不同畜禽的免疫增强作用

动物在物种进化过程中，其TLR－9的基因也逐步在种间变异，不同种类的动物体内表达的TLR－9在结构上存在一定的差异，比如人和小鼠TLR－9的结构就有24%的不同 ［20］。所以不同动物体内的TLR－9所识别的CpG ODN也不尽相同。因此，CpG ODN的免疫刺激活性具有种属特异性，具体表现为不同的CpG基序可能针对不同种属的动物具有免疫刺激活性，例如，GTCGTT对人淋巴细胞具有良好的刺激活性，是人敏感基序；GACGTT对鼠淋巴细胞具有良好的刺激活性，是鼠敏感基序 ［21］。在研究CpG ODN免疫佐剂效应的时候需要根据不同的靶动物设计符合特殊要求的碱基序列。

到目前为止，国内外的研究人员已经根据不同动物的最佳基序设计合成，并通过体外和体内实验筛选出了上千条对各种畜禽包括水产动物具有免疫刺激活性的CpG ODN序列。例如对猪有较强刺激活性的5′－TCCATGACGTTCCTGACGTT－3′、5′－ATCGATATCGAT－3′、5′－GACGTTGACGTT－3′、5′－GACGTTGACGTT－3′；对牛有较强刺激活性的5′－TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT－3′、5′－TCGTCGTTTTGTCGTTTGTCGTT－3′、5′－TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT－3′；对鸡有较强刺激活性的5′－TCGTCGTTTTGTCGTTTT－GTCGTT－3′；对犬有较强刺激活性的5′－GGTGCATCGATGCAGGGGGG－3′；对虾蟹有刺激活性的5′－TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG－3′等等 ［22－24］。这些CpG ODN均能提高相应动物机体免疫应答的强度，提高疫苗的免疫效果。一些研究还表明，CpG ODN作为疫苗佐剂使用时，既可以单独发挥免疫增效作用，也可与传统的氢氧化铝佐剂一起发挥协同作用，说明CpG ODN具有十分广阔的应用前景。

在体外筛选有刺激作用的CpG ODN时，同一动物的外周血单个核细胞和脾细胞有时会表现出差异较大的反应性，即除了种属特异性，CpG ODN对同一动物不同亚群细胞也会体现出不同的刺激能力。另外，CpG ODN往往是由若干个CpG基序组合在一起才具有更强的刺激活性，影响刺激活性的因素还包括核酸骨架的硫代修饰和碱基的回文结构等，在筛选新的CpG ODN时应注意其刺激活性的复杂性。

5 CpG ODN作为疫苗佐剂使用的安全性

由于CpG ODN能够减少受刺激淋巴细胞的凋亡，诱导多克隆的B细胞活化，提高自身免疫性抗体和促炎细胞因子的产生，从而可能导致自身免疫性疾病的发生。而在CpG ODN的刺激下，机体反复的产生TNF－α，其结果是有可能造成动物发生中毒性休克。另外，CpG ODN引起机体的免疫应答趋向于Th1型反应，因此也更有可能促使器官特异性自身免疫性疾病的发生。但上述不良反应只是理论上的可能，在实际应用时由于疫苗中CpG ODN的剂量较低，不足以诱发或加重系统性自身免疫。在小鼠体内进行多次注射免疫刺激剂量的CpG ODN后，尽管分泌抗DNA的IgG抗体的B细胞的数量上升了2倍～3倍，血清中抗DNA的IgG抗体的滴度提高了60%，但这些变化并没有使小鼠发病 ［25］。

现有的临床试验也没有发现注射CpG ODN后，动物机体出现严重的临床症状和病理变化。在CpG佐剂疫苗和传统佐剂疫苗的对比试验中，二者安全性方面的数据基本一致。总的来说，CpG ODN在动物体内发挥免疫佐剂效应的同时，其安全性还是很强的。不过有时候还是会在注射部位出现疼痛、肿胀、硬化、瘙痒、红斑和出现系统性症状，如流感样症状等 ［26］。所以，在试验和临床应用中依然要注意安全性问题，主要是避免使用剂量过大。

6 展望

CpG ODN是一种非常理想的新型疫苗佐剂，在人用乙型肝炎疫苗中已经通过了Ⅲ期临床研究，还在其他很多人用疫苗中也已经进入到Ⅱ期、Ⅲ期临床研究阶段 ［2］，但在兽用疫苗中的应用还比较滞后。由于CpG ODN本身作用的种属特异性，使得研究者必须针对不同的动物找到能够在该种动物体内稳定发挥免疫佐剂效应的CpG ODN。尽管目前研究人员已经设计筛选出许多对多种动物有效的CpG ODN，但是还不能确定这些CpG ODN是否就是对该种动物是最有效的。除了猪、牛、羊、鸡、犬、猫等常见畜禽，毛皮动物水貂、狐狸的特异性CpG ODN序列目前还未见报道，而CpG ODN实际上正适合作为这些体型小、价值高的经济动物的疫苗佐剂。所以，设计和筛选新的CpG ODN还有一定的研究空间。

此外，为了更好的掌握CpG ODN的免疫刺激功能，更有效的发挥其作为免疫佐剂的能力，还需要进一步深入研究其作用机制。清楚的了解CpG ODN影响基因表达的信号通路有利于人们设计更有效的CpG ODN或发现其他影响这一途径的方法。探究最佳免疫剂量和持续时间也是优化CpG ODN使用的一个重要内容。由于对不同畜禽具有免疫刺激活性的CpG ODN序列的报道已经足够多，目前科研人员已经将更多的目光集中在如何提升CpG ODN的应用效果上，比如应用纳米颗粒技术和脂质体包埋技术来使CpG ODN的刺激活性发挥得更好。总之，CpG ODN的免疫增强作用已经受到人们的一致认可，但要将这种免疫佐剂应用到生产实践，CpG ODN作为一种新型佐剂在兽医领域的研究还不够成熟。随着各项研究的深入进行，CpG ODN未来将很有可能成为广泛使用的一种疫苗佐剂，在动物传染病防控方面发挥重要作用。