2株人参生防真菌发酵液稳定性的研究

肖春萍，韩 梅，杨利民

（吉林农业大学中药材学院，省部共建生态恢复与生态系统管理国家重点实验室培育基地，吉林长春130118）

2株人参生防真菌发酵液稳定性的研究

肖春萍，韩 梅，杨利民

（吉林农业大学中药材学院，省部共建生态恢复与生态系统管理国家重点实验室培育基地，吉林长春130118）

采用含毒介质培养法及菌丝生长速率法，研究了2株人参生防真菌FSR－74和FSR－97发酵液的稳定性.结果表明：2株生防真菌发酵液的热稳定性较弱，其发酵液在低温下（≤40℃）抑菌活性稳定，在中高温下（＞40℃）抑菌活性逐渐下降乃至失活；2株生防真菌发酵液的酸碱稳定性较差，在pH＜5或pH＞9的条件下其抑菌活性逐渐减弱；生防真菌FSR－74发酵液具有较强的紫外稳定性，但生防真菌FSR－97发酵液的紫外稳定性较弱；生防真菌FSR－74和FSR－97发酵液具有较好的低温储藏稳定性，室温下随储藏时间的延长对人参病原菌的抑菌率均显著下降；2株生防真菌发酵液抗胰蛋白酶稳定性较差；生防真菌FSR－74和FSR－97均具有良好的传代稳定性.生防真菌FSR－74和FSR－97的代谢产物有较强的低温储藏稳定性，具有一定开发价值，在不同植物病害防治应用中应在合理的温度、光照及pH范围内使用.

人参；生防真菌；发酵液；稳定性

人参（Panax ginseng C.A.Mey）为五加科人参属多年生宿根阴性双子叶药用植物，是我国的名贵药材，有“百草之王”的美誉.人参在中国、韩国、朝鲜、俄罗斯等国家均有大面积种植.其中，中国东北特别吉林省是人参的主产区，已成为当地的重要支柱产业之一［1］.人参的长期人工种植导致人参种质退化、病害严重，人参制品质量差、产量低.长期以来通过使用化学农药等化学防治措施防治人参病害并未达到预期效果，而且化学农药过量使用不仅会破坏土壤微生态环境，加重环境污染，也使有毒物质在参根内大量积累，降低了人参的使用安全性和商品价值［2］.因此，植物病害防治重点逐步转向了生物防治和农业防治措施上.在农作物植物保护领域，利用作物的健株根际土壤筛选对病原菌具有显著生防效果的土壤微生物，并制成微生物菌剂，这是生物防控研究的重要手段之一，也是有益微生物资源开发利用的重要途径［3］.

真菌是一类具有巨大实用价值的微生物，其中已有许多类群被应用于植物病害的防治［4－5］，真菌中含有的多种抑菌活性物质逐渐受到人们的关注.真菌发酵产物施用时，会受到阳光、温度、土壤的酸碱性等各种因素的影响，因此，真菌发酵产物在各种环境条件下的稳定性是评价该真菌是否有开发价值的重要指标之一［6］.热稳定性、酸碱稳定性等也是微生物次级代谢产物开发的重要衡量依据［7］.本文从人参健株根际土壤中分离筛选出2株具有高效广谱抑菌活性的生防真菌FSR－74和FSR－97，对其在热、酸碱、紫外线等条件下的稳定性进行了研究，以为菌株FSR－74和FSR－97的进一步开发利用提供评价依据和实践基础.

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1 供试菌株

人参生防真菌FSR－74和FSR－97，筛选自人参健株根际土壤.

1.1.2 供试靶标菌

选用5种引起人参真菌性病害的病原菌，分别为引起人参根腐病、锈腐病、黑斑病、立枯病及人参灰霉病的腐皮镰孢菌（Fusarium solani）、毁灭柱孢菌（Cylindrocarpon destructans）、人参链格孢菌（Alternaria panax）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）和灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），以上菌株均由吉林农业大学农学院植物病理实验室分离、鉴定.

1.2实验方法

1.2.1 人参生防真菌无菌发酵液的制备

将保存的人参生防真菌FSR－74，FSR－97菌株在PDA平板上分别进行活化，并用打孔器各取2个5mm菌饼分别接入到50mL的葡萄糖马铃薯液体培养基（PDB）中，25℃，170r／min振荡培养48h，得到种子液；种子液以10%的接种量接入到100mL的PDB液体培养基中进行二次发酵，25℃，170r／min振荡培养4d后获得培养液；将培养液8 000r／min离心20min，上清液即为发酵液；发酵液经细菌过滤器（滤膜孔径0.22μm）过滤获得无菌发酵液.

1.2.2 生防真菌发酵液稳定性研究

（1）发酵液的热处理.将2株生防真菌的发酵液分别于40℃，60℃，80℃，100℃和120℃条件下处理60min，每个处理3次重复.待自然冷却后，以原发酵液为对照，分别测定其对各人参病原菌的抑菌活性.

（2）发酵液的酸碱处理.将2株生防真菌发酵液用1mol／L HCI和1mol／L NaOH分别调整pH至3，5，7，9，11和13，静置6h后，再分别将各发酵液的pH慢慢调至原发酵液的pH值7.2，每个处理3次重复.以原发酵液为对照，分别测定其对各人参病原菌的抑菌活性.

（3）发酵液的紫外处理.将2株生防真菌发酵液置于30W紫外灯下（距灯管20cm）分别照射30，60，90，120和150min，每个处理3次重复.以原发酵液为对照，分别测定其对各人参病原菌的抑菌活性.

（4）储藏稳定性测定.将2株生防真菌发酵液分别置于室温（25℃）和4℃冰箱内，保存1，8，15，22和29d，每个处理3次重复.以原发酵液为对照，分别测定其对各人参病原菌的抑菌活性.

（5）抗胰蛋白酶K稳定性的测定.分别在2株生防真菌的1mL发酵液中加入5μL胰蛋白酶K溶液（质量浓度20mg／mL），充分混匀并置于37℃摇床中抚育2h，每个处理3次重复.以原发酵液为对照，分别测定其对各人参病原菌的抑菌活性.

（6）传代稳定性研究.将2株生防真菌在PDA平板上连续传代10次，每隔7d传代1次，观察每代菌株的培养特征是否一致；采用含毒介质培养法测定各代菌株发酵液的抑菌活性，以第1代菌株发酵液为对照，每处理3次重复.

1.2.3 对人参病原菌抑菌活性的研究

采用含毒介质培养法及菌丝生长速率法［8］测定FSR－74和FSR－97菌株无菌发酵液对5种人参病原菌的抑菌作用.分别将FSR－74和FSR－97无菌发酵液与PDA培养基按1∶4的比例（体积比）混合，配制成含药培养基，然后将5种人参常见病原菌菌饼分别置于相应含药培养基中央，以混合无菌水作空白对照，5次重复，25℃下恒温培养，6d后测量各人参病原菌菌落半径并计算抑菌率.

抑菌率＝（对照菌落扩展半径－处理菌落扩展半径）／对照菌落扩展半径×100%

1.3数据处理

所得实验数据采用Excel和DPS 7.05软件进行统计分析.采用单因素方差分析（Duncan’s新复极差法）进行生防真菌发酵液稳定性差异显著性的检验.

2 结果与分析

2.1生防真菌发酵液热稳定性

由图1可知，人参生防真菌FSR－74和FSR－97发酵产物中的活性物质热稳定性较差.菌株FSR－74和FSR－97的发酵液经过不同温度处理后，随处理温度升高，其对腐皮镰孢菌、毁灭柱孢菌、链格孢菌和立枯丝核菌的抑制率逐渐下降，但对灰葡萄孢菌的抑制作用影响不大.其中，菌株FSR－74发酵液经40℃处理后，对腐皮镰孢菌、毁灭柱孢菌的抑菌率分别下降33.33%和31.41%；经60℃处理后，对立枯丝核菌的抑制率下降显著；40℃～100℃处理时，对人参链格孢菌的抑制率影响不显著；120℃处理60min后，对腐皮镰孢菌、毁灭柱孢菌、人参链格孢菌、立枯丝核菌和灰葡萄孢菌的抑菌率分别比对照下降了77.75%，46.64%，59.43%，50.70%和35.47%.菌株FSR－97发酵液经60℃处理后，对毁灭柱孢菌和人参链格孢菌的抑制率下降显著，分别比对照下降了33.38%和45.26%；60℃～100℃处理时，对各人参病原菌抑菌率的影响不明显；120℃处理60min后，对腐皮镰孢菌、毁灭柱孢菌、人参链格孢菌、立枯丝核菌和灰葡萄孢菌的抑菌率分别比对照下降了61.18%，74.43%，74.19%，54.64%和10.22%.处理结果说明，低温条件下（≤40℃），两株生防真菌发酵液的稳定性较高；中高温条件下（＞40℃），两株生防真菌发酵液中的活性成分容易分解或易失活；两株生防真菌发酵液热处理后，对灰葡萄孢菌抑菌率的影响较小，且菌株FSR－97的热稳性优于FSR－74.

2.2生防真菌发酵液酸碱稳定性

由图2可知，生防真菌FSR－74，FSR－97发酵液经中性条件处理后，其活性物质的稳定性较好，但经酸性及碱性条件处理后，其活性物质的稳定性变差，且随酸碱强度的增大，对活性物质的影响增大.pH＝5或pH＝9时，两株生防真菌发酵液对人参病原菌的抑菌率逐渐降低；在pH＝3时，菌株FSR－74发酵液对人参病原菌的抑菌率显著下降了12.55%～77.87%，菌株FSR－97对人参链格孢菌、毁灭柱孢菌、立枯丝核菌和灰葡萄孢菌的抑菌率显著下降了30.67%～87.29%；在pH＝9时，菌株FSR－97发酵液对腐皮镰孢菌的生长无抑制作用；而pH＝13时，菌株FSR－74发酵液对人参病原菌的抑菌率下降了54.21%～66.80%，菌株FSR－97发酵液对毁灭柱孢菌、立枯丝核菌和灰葡萄孢菌的抑菌率下降了32.99%～90.70%.因此，两株生防真菌在发酵液活性物质分离、纯化及使用过程中，酸碱性强度应保持中性.

2.3生防真菌发酵液紫外稳定性

由图3可知，随紫外线照射时间的延长，菌株FSR－74的发酵液对5种人参病原菌生长的抑制率基本无显著变化，说明生防真菌FSR－74发酵液对紫外线不敏感，有较强的紫外线照射稳定性.生防真菌FSR－97的发酵液对紫外线较为敏感，紫外线照射时间延长至150min后，对5种人参病原菌的抑制率下降了21.65%～61.29%，说明菌株FSR－97紫外稳定性较差，其发酵液在使用及保存时应尽量避光.

2.4生防真菌发酵液储藏稳定性

由图4可见，在4℃条件下，生防真菌FSR－74和FSR－97发酵液的储藏稳定性较强；25℃储藏22d后，FSR－74和FSR－97发酵液抑菌活性下降.29d时，菌株FSR－74的发酵液在4℃条件下，对人参链格孢菌、毁灭柱孢菌和灰葡萄孢菌的抑菌率下降了9.21%～33.56，对立枯丝核菌的生长无显著的抑制作用；在室温条件下，对5种人参病原菌的抑菌率下降了35.42%～82.34%.菌株FSR－97的发酵液在4℃条件下储藏29d时，对5种人参病原菌的抑菌率下降了13.76%～61.39%；而在室温条件下，对5种人参病原菌的抑菌率下降了22.42%～87.28%.因此，两株生防真菌发酵液的低温储存稳定性较好，在低温条件下，生防真菌FSR－74和FSR－97的发酵液能在29d之内保持较高的抑菌活性.

2.5生防真菌发酵液抗胰蛋白酶K稳定性

由图5可见，两株生防真菌的发酵液经胰蛋白酶K处理后，对5种人参病原菌的抑菌率显著低于对照，说明生防真菌FSR－74和FSR－97发酵后产生的抑菌活性物质在酶处理后稳定性变差.

2.6生防真菌发酵液传代稳定性研究

从各代培养特征看，FSR－74，FSR－97在连续传代过程中的形态特征与原始菌株相同；从抑菌活性看，FSR－74，FSR－97经连续10次传代培养后，其发酵液的抑菌活性基本不变（见图6），说明生防真菌FSR－74和FSR－97具有良好的传代稳定性.

3 结论

由于微生物农药的低毒、高效等特点，利用生防微生物防治植物病原微生物已成为生物防治技术的重要组成部分［9］.目前真菌是研究、生产和应用最多的一类生防微生物.生防真菌在发酵过程中产生的次生代谢产物已被作为微生物农药进行开发利用［6］.人参生防真菌FSR－74，FSR－97发酵液具有高效广谱的抑菌活性，研究其代谢产物的广谱性及稳定性，对评价其在植物病害防治中的开发利用价值有重要意义.

对生防真菌FSR－74和FSR－97发酵产物稳定性的研究结果表明：两株生防真菌发酵液在低温储存、中性条件、使用温度低于40℃及适量光照时，其抑菌活性稳定；使用及储藏温度高、光照强、pH偏高或偏低时，都会导致发酵液抑菌活性的下降或失活.有研究发现，生防真菌通过产生有抑菌活性的物质［10－11］或产生细胞降解酶［12］来抑制病原菌的生长，进而达到防治植物病害的目的.菌株FSR－74和FSR－97发酵液由于温度、光照、酶及pH的影响，可导致活性物质成分改变或作用酶失活，进而丧失抑菌活性.因此，生防真菌FSR－74和FSR－97发酵液的制备及其在不同植物病害防治的应用时应在合理的温度、光照及pH范围内使用.另外，本实验的发酵液为多种成分的复合体，不同条件对不同人参病原菌的抑菌稳定性影响不同，因此发酵液中有效成分的含量及分子结构还有待进一步的深入研究.

［1］ 杨利民，陈长宝，王秀全，等.长白山区参后地生态恢复与再利用模式及其存在的问题［J］.吉林农业大学学报，2004，26（5）：546－549.

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Study on stability of fermentation broth from two antagonistic strains of Panax ginseng

XIAO Chun－ping，HAN Mei，YANG Li－min

（Chinese Medicinal Material College，Co－constructing Cultivation Base－key Laboratory by Province and the MOST of Ecological Restoration and Ecosystem Management，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

By means of containing poisonous medium culture and mycelial growth rate method，the stabilities of fermentation broths from antagonistic fungi strains FSR－74and FSR－97of Panax ginseng were studied.The results showed that thermal stability of fermentation broths from FSR－74and FSR－97was stable less than 40℃and the activities were decreased gradually or lost in high temperature（＞40℃）.The pH stability of fermentation broths from FSR－74and FSR－97was poor，and its antimicrobial activity was weakened gradually in the condition of pH＜5or pH＞9.UV stability of FSR－74fermentation broth was stronger while weaker for FSR－97fermentation broth.The fermentation broths from FSR－74and FSR－97were stable when storing in low temperature.The inhibition rates of FSR－74and FSR－97fermentation broths against ginseng pathogens was decreased significantly with the extension of storage time when storing in room temperature.Meanwhile，the fermentation broths from FSR－74and FSR－97were astable to trypsin K，while the antimicrobial activity of fermentation broths had no significant changes when the two strains were transferred for 10 generations.The active substances fermented by FSR－74and FSR－97with better storing stability have a value for development.As well as the temperature，illumination and pH must be controlled in a proper range in the prevention and control of plant diseases.

Panax ginseng；pathogenic fungi；fermentation broth；stability

S 432.2 ［学科代码］ 210·60 ［

］ A

（责任编辑：方林）

1000－1832（2015）01－0105－06

10.16163／j.cnki.22－1123／n.2015.01.020

2014－09－27

国家科技支撑计划项目（2011BAI03B01－02）；国家自然科学基金资助项目（31270371）；吉林省科技发展计划重点项目（20125068）.

肖春萍（1985—），女，博士研究生，主要从事药用植物、土壤微生物区系变化研究；通讯作者：杨利民（1963—），男，博士，教授，博士研究生导师，主要从事药用植物资源开发与利用研究.