前列腺癌中CIP2A的表达及意义

张延辉，徐 涛，赵燕辉，刘春雷

（青岛市中心医院泌尿外科，山东266042）

前列腺癌中CIP2A的表达及意义

张延辉，徐 涛，赵燕辉，刘春雷

（青岛市中心医院泌尿外科，山东266042）

目的 探讨蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子（CIP2A）在前列腺癌组织中的表达及其与临床病理参数的关系。方法 收集2011年12月至2014年11月该院泌尿外科前列腺癌（80例）和前列腺增生（25例）组织标本进行研究。应用RT-PCR和免疫组织化学分别检测标本组织中CIP2AmRNA和蛋白表达情况。结果 CIP2A在前列腺癌组织中的阳性表达率（70%，56/80）明显高于前列腺增生组织（16%，4/25），差异有统计学意义（P＜0.01），CIP2A在前列腺癌中表达与高Gleason评分、高T分期、淋巴结转移有关，差异均有统计学意义（P＜0.05），但CIP2A表达与前列腺特异性抗原（PSA）水平无明显相关性（P＞0.05）。结论 CIP2A在前列腺癌的发生发展中可能起促进作用，与前列腺癌的发生、分化和淋巴结转移有一定关系，有可能成为判断前列腺癌预后的新标志和临床治疗的新靶点。

前列腺肿瘤； 磷蛋白磷酸酶类； 免疫组织化学； 肿瘤分期； 抑制因子，免疫

前列腺癌的发病率有明显的地理和种族差异，其在美国是危害男性健康的首位肿瘤疾病；前列腺癌在中国的发病率也有显著上升，1994～2002年，前列腺癌发病率每年增长13.4%[1]。因此，进一步寻找诊断前列腺癌的分子标志物及治疗靶点十分重要。蛋白磷酸酶2A（protein phosphortase 2A，PP2A）是三聚体全酶，其在调节相关的致癌活性和一些主要的肿瘤信号通路中起着不可或缺的作用，PP2A的癌性抑制因子（cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A，CIP2A）通过抑制细胞内的PP2A稳定c-Myc蛋白表达，促进细胞转化和肿瘤细胞的生长[2]。有报道表明，CIP2A在人乳腺癌[3]、结肠癌[4]、肝癌[5]、胃癌[6]、鼻咽癌[7]、肺癌[8]、皮肤恶性黑色素瘤[9]的发生发展中起重要作用，但目前尚少见CIP2A在前列腺癌中的相关研究报道。本文探讨CIP2A在前列腺癌和前列腺增生组织中表达及其与临床病理参数的关系。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 标本来源 收集2011年12月至2014年11月本院泌尿外科前列腺癌（80例）和前列腺增生症（25例）组织标本进行研究。标本通过经尿道前列腺等离子汽化切除术或前列腺根治性切除术取得，其中80例前列腺癌标本中有25例通过前列腺癌根治性切除术中获得，有55例标本通过经尿道前列腺电切术获得，所有标本均得到患者授权。收集所有前列腺癌患者Gleason评分、肿瘤分期和前列腺特异性抗原（prostatespecific antigen，PSA）水平。

1.1.2 试剂 兔抗人CIP2A多克隆抗体购自Imgenex公司，羊抗兔抗体购自SantaCruz公司，Trizol购自Invitrogen公司，PCR引物、100 bp DNA标准参照物、RTPCR试剂盒购自TaKaRa公司，碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学检测CIP2A蛋白表达 采用过氧化物酶标记的链霉卵蛋白素（SP）法，步骤如下：（1）石蜡切片60℃烤箱烤片2 h，常规脱蜡、水化。（2）3%过氧化氢去离子水37℃孵育10min，高温修复抗原30min（微波法修复）并冷却至室温，滴加封闭血清，37℃孵育20min，滴加CIP2A一抗工作液，阴性对照以PBS代替一抗，4℃冰箱中孵育过夜。（3）滴加生物素标记二抗37℃孵育30min，滴加链霉亲和素-过氧化物酶，室温或37℃孵育30min，滴加二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）进行显色，苏木精复染，显微镜下观察。CIP2A的表达主要位于细胞质，细胞质染色为棕黄色为阳性。根据标本细胞染色质染色强度分为4个等级：无着色记为0，弱染色记为1，中度染色记为2，强染色记为3，对CIP2A的表达进行评分。免疫组织化学结果由2名观察员独立评估，观察者独立评估计算，当评分结果相差较大时需扩大高倍镜选择视野后由2名评分者讨论决定评分结果。

1.2.2 RT-PCR检测CIP2AmRNA表达 取组织冷冻标本，将冷冻样本组织剪碎后超声破碎，Trizol法提取细胞总RNA，RT-PCR实验过程按照TaKaRa试剂盒中的反转录说明获得总cDNA，应用Primer 5分别设计CIP2A和β-actin引物。CIP2A上游引物为5′-GTCTGGAATGGTGGTAAA-3′，下游引物为5′-TGTGAGGGTGTACTATCG-3′，扩增长度843 bp；内参β-actin上游引物为5′-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3′，下游引物为5′-CAGGGTACATGGTGGTGCTGCC-3′，扩增长度452 bp。反应结束后，取5μL扩增产物在按照PCR产物用2.0%琼脂凝胶电泳，电泳结束后置于GeneSnap from SynGene成像系统成像鉴定。以CIP2A/β-actin值表示CIP2AmRNA的相对表达量。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，组间CIP2A阳性率比较采用χ2检验，CIP2A表达与前列腺癌临床病理参数的关系采用相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 前列腺增生和前列腺癌组织中CIP2A蛋白的表达情况 CIP2A的表达主要位于细胞质，56例（70%）前列腺癌组织标本CIP2A表达阳性，而在前列腺增生组织标本中仅检测到4例（16%）CIP2A表达阳性，其余均为阴性，前列腺癌标本中CIP2A表达显著高于前列腺增生标本，差异有统计学意义（P<0.01），见图1、2。

2.2 CIP2A与前列腺癌临床病理特征的关系 CIP2A的染色强度随着前列腺癌Gleason评分的增高而增加，Gleason评分大于或等于7分（83.7%，41/49）的CIP2A阳性率高于Gleason评分小于7分（48.4%，15/31），差异有统计学意义（P=0.001）。CIP2A染色强度在不同PSA值间比较，差异无统计学意义（P=0.801）。临床T分期：T3+T4期组中CIP2A阳性率（80.0%，44/55）明显高于T1+ T2期组（44.0%，11/25），差异有统计学意义（P=0.002）。伴淋巴结转移组CIP2A阳性率（81.5%，44/54）高于无淋巴结转移组（46.2%，12/26），差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

图1 前列腺增生和前列腺癌组织中CIP2A蛋白的表达

图2 RT-PCR检测CIP2AmRNA表达

表1 CIP2A与前列腺癌临床病理特征的关系[n（%）]

3 讨 论

前列腺癌是威胁中老年男性健康的常见恶性肿瘤，在美国，前列腺癌的发病率已经超过肺癌，病死率较高；在我国，随着经济的发展，人寿命的不断延长和生活方式的改变，前列腺癌的发病率和病死率也逐年上升。大部分前列腺癌患者因排尿症状改变或者骨痛就诊，仅6.2%的患者因血清PSA升高而就诊[1]。

CIP2A又称为kiaa1524或P90的肿瘤相关抗原，是一种可以促进恶性肿瘤转化和维持恶性表型的癌蛋白。2007年，Junttila等[10]研究发现，CIP2A基因定位于染色体3q13.13，其DNA长度约为38.8 kb，mRNA长为4 284 bp，有一个编码905个氨基酸的开放读码框（ORF），含有21个外显子，相对分子质量为102×103，CIP2A通过抑制PP2A对癌转录因子c-Myc的S62位点的去磷酸化作用，抑制了体内PP2A的抑癌作用，最终导致细胞转化和肿瘤生长，结果证实，CIP2A是一种癌蛋白，且可通过与致癌性转录因子c-Myc直接相互作用，也通过抑制PP2A对c-Myc基因S62位点的去磷酸化作用，从而进一步抑制c-Myc蛋白水解，稳定c-Myc蛋白的表达水平，并且CIP2A与c-Myc之间为正反馈关系。Liu等[3]通过shRNA沉默乳腺癌细胞中的CIP2A发现，CIP2A在通过促进癌细胞增殖并降低癌细胞凋亡起作用。Shi等[9]通过siRNA干扰CIP2A研究恶性黑色素瘤的侵袭性，证实CIP2A可促进恶性黑色素瘤的侵袭转移。Ding等[4]研究抗癌药物硼替佐米对结肠癌的作用时，发现硼替佐米在抗肿瘤的同时可降低CIP2A的表达，说明CIP2A在硼替佐米抑制结肠癌中起着重要作用。在胃癌细胞系中，幽门螺杆菌通过Src蛋白和Ras、促分裂原活化蛋白激酶、细胞外信号调节激酶途径介导CIP2A的表达[6]。这些途径在雄激素生成中起着重要作用[11]，从而可通过这些途径治疗转移性前列腺癌。

本研究结果显示，CIP2A在前列腺癌中高表达，在前列腺增生中低表达，表明CIP2A在前列腺癌的诊断中具有很好的灵敏性，可作为一项早期筛查指标。CIP2A的高表达更倾向于高Gleason评分、高临床TNM分期及有淋巴结转移的患者，并与淋巴结转移相关，而与血清PSA无相关性。Gleason评分、高临床TNM分期及有淋巴结转移被认为是评价前列腺癌预后的重要指标，因此推测，CIP2A可能在前列腺癌发生发展中起着极其重要的作用，但未发现CIP2A mRNA及蛋白表达与血清PSA相关，可能因为不同患者的血清PSA变化较大，同时前列腺按摩、前列腺穿刺活检、急性尿潴留、导尿等均有可能导致PSA一过性升高，本研究样本量有限也可能是原因之一。前列腺癌的诊断需要新的并且能反映疾病进展程度的标志物。肝细胞癌、胃癌和食管癌的血清CIP2A抗体分别为13%、5%、3%[12]。CIP2A抗体在前列腺癌血清中表达有30%，而良性前列腺增生患者只有1.5%。此外，Gleason评分大于或等于7分的前列腺癌血清CIP2A抗体表达率明显高于Gleason评分小于或等于6分的患者，分别为29%、16%[13]。上述研究结果说明，CIP2A或CIP2A血清抗体有助于判断前列腺癌的生物学行为。

本研究中，应用RT-PCR可检测CIP2AmRNA，免疫组织化学可检测CIP2A蛋白量，更加准确表明CIP2A在前列腺癌中的表达。本研究结果表明，CIP2A蛋白在前列腺癌中表达增高，且与前列腺癌临床生物学行为相关，说明CIP2A是前列腺癌发生发展中一个新的分子标志物。

综上所述，CIP2A在前列腺癌中高表达，并且与高Gleason评分、高临床T分期及淋巴结转移相关，提示CIP2A可能在前列腺癌的发生、分化、侵袭转移中有一定的促进作用，可能成为诊断前列腺癌的新标志物和基因治疗的新靶点。

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Expression of CIP2A and its clinical significance in prostate cancers

Zhang Yanhui，Xu Tao，Zhao Yanhui，Liu Chunlei
（DepartmentofUrinary Surgery，Qingdao CenterHospital，Shandong266042，China）

Objective To detect theexpression ofCIP2A ofprotein phosphatase2A in prostate cancer tissuesand toexplore its correlation with prostate cancer clinicopathological parameters.M ethods Itwas collected tissue samples from 80 patientswith prostate cancerand 25 patientswith prostatichyperplasia to explore further.The expression of CIP2AmRNA and protein were detected by RT-PCR and immunohistochemistry.Results The positive rate of CIP2A in prostate cancer tissues（70%，56/80）was significantly higher than thatofbenign prostatic hyperplasia tissues（16%，4/25），and therewas a statistically significantdifference（P＜0.01）.Increased expression of CIP2A wasmore often detected in prostate cancer with high Gleason scoring，advanced T stage，lymph nodemetastasis.Itshowed statistical significance in difference（P＜0.05）.Itwas detected that CIP2A expressionhad rare correlation with PSA concentration（P＞0.05）.Conclusion CIP2A may play an important role in carcinogenesisand progression of prostate cancer.The expression of CIP2A has a certain relationship with tumorigenesis，differentiation and lymph nodemetastasis.CIP2Amay bea sign for prognosisand new target for clinical treatmentand ofprostate cancer.

Prostatic neoplasms； Phosphoprotein phosphatases； Immunohistochemistry； Neoplasm staging；Suppressor factors，immunologic

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.09.006

A

1009-5519（2015）09-1295-03

2014-12-20）

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本刊编辑部

张延辉（1984-），男，山东德州人，硕士研究生，主要从事泌尿系肿瘤基础与临床研究；E-mail：zhangyanhuihs@163.com。

刘春雷（E-mail：271194250@qq.com）。