芝麻茎点枯病菌两种细胞壁降解酶活性分析

高树广，赵 辉，李伟峰，王瑞霞，倪云霞，杨修身，刘红彦＊，杨光宇

（1.河南省农业科学院植物保护研究所，郑州 450002；2.河南省周口市农业科学院，周口 466001）

芝麻茎点枯病是危害芝麻最严重的真菌病害之一，该病害破坏性强，每年造成的损失高达30%以上。引起芝麻茎点枯病的病原菌菜豆壳球孢［Macrophominaphaseolina（Tassi）Goid］［1］，在世界范围内能侵染500多种植物，具有土传和种传的特性，其菌核能在土壤或病残体上存活4年以上［2］。

植物细胞壁是防止病原真菌侵入的屏障，也是寄主与病菌互作的重要场所［3］，植物细胞壁主要由多糖（如纤维素、半纤维素和果胶）、蛋白质和木质素等构成［4］。在长期的进化过程中，植物病原真菌能产生可降解植物细胞壁成分的胞外酶，这些酶通过消化植物细胞壁聚合物为病菌生长提供营养物质，辅助其在寄主组织中定殖和扩散［5］。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，不但可降解木质素［6］，而且可促进纤维素和果胶等细胞壁成分的降解。研究表明，漆酶是许多病原真菌致病的毒力因子，例如，漆酶与板栗疫病菌的致病力［7］、根瘤菌的抗逆性和致病性密切相关［8］，在新生隐球菌的致病过程中起重要作用［9］。Islam 等对M.phaseolina基因组测序分析表明，其木质素降解酶系统包括漆酶、木质素过氧化物酶、半乳糖氧化酶、氯过氧化物酶、卤过氧化物酶、血红素过氧化物酶［10］。另一种细胞壁降解酶，聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）能作用于α-1，4键，使果胶中的聚半乳糖醛酸水解，释放出单体的半乳糖醛酸，进而促使细胞的裂解。冯晶等［11］的研究结果表明，玉米弯孢霉叶斑病菌能按照一定的顺序产生一系列细胞壁降解酶。陈夕军等［12］认为水稻纹枯病菌（Rhizoctoniaso-laniKühn）的细胞壁降解酶在水稻纹枯病的暴发过程中起着重要作用，陈兵等［13］认为果胶酶与水稻纹枯病菌的致病性关系密切。目前，关于芝麻茎点枯病菌产生的细胞壁降解酶种类及活性分析鲜有报道［14-18］。本研究测定了芝麻茎点枯病菌漆酶（Lac）和聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）活性，分析比较了其变化规律，旨在为芝麻茎点枯病菌致病机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

芝麻茎点枯病菌共9株，分别于2009-2010年采集于河南、江西和安徽省，由河南省农业科学院植物保护研究所生防室分离保存（表1）。

表1 供试菌株Table 1 The tested strains

1.2 方法

1.2.1 菌株培养

将-20 ℃保存的9 株芝麻茎点枯病菌接种在PDA 培养基上，30 ℃黑暗培养2d，再转接至新鲜PDA 培养基上30 ℃黑暗培养4d，备用。

1.2.2 芝麻茎点枯病菌漆酶活性

1.2.2.1 漆酶活性检测

在培养4d的菌落平板上打取菌饼（d＝6mm），将菌饼分别接种到含0.03% ABTS［2，2-联氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐］和3g／L KNO3的PDA培养基平板中间、含0.01% 苯胺蓝（azure-B）的BM 培养基（酵母膏10g，葡萄糖20g，琼脂粉18g，水1 000mL）平板中间［19］，以菌饼接种在PDA培养基平板中间为空白对照，30℃黑暗培养3d。每天观察培养基颜色变化情况，每个处理3次重复。

1.2.2.2 芝麻茎点枯病菌漆酶活性测定

将培养4d的产漆酶菌株菌饼接种到含有20mL Fries培养基（蔗糖30g，酒石酸钾钠7.7g，酵母提取物0.5g，NH4NO31g，KH2PO41g，MgSO40.5g，NH4Cl 2.9g，CaCl20.1g，CuSO4·5H2O 0.625g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 4.0）的50 mL 三角瓶中，30 ℃黑暗静置培养10d。培养物10 000r／min离心10 min，上清液用于胞外酶活力测定。菌丝用0.1mol／L Tris-HCl（pH 4.0）缓冲液冲洗2次后，加1mLTris-HCl重悬菌丝，-20 ℃冰冻过夜。在冰上迅速将冰冻的菌丝研磨成匀浆后转移至10mL离心管中，再用1mL Tris-HCl缓冲液冲洗研钵，洗液转入同一离心管，4℃10 000r／min离心10min，吸出上清液，即为粗酶液，用于胞内酶活力测定。漆酶活力测定参照曹志艳等［18］的方法。在420nm 波长下，连续测定前5min内吸光值的变化，按下式计算漆酶活力。漆酶活力单位定义为1min内，1mL酶液的吸光值变化0.01个单位所需酶量为1个酶活力单位（U）。胞内酶和胞外酶粗酶液制备与测定均3次重复，取平均值。

式中At1表示反应起始时的吸光度，At2表示反应终止时的吸光度，t1表示反应起始时的时间，t2表示反应终止时的时间。

1.2.3 芝麻茎点枯病菌聚甲基半乳糖醛酸酶活性

1.2.3.1 葡萄糖标准曲线的制作

称取50mg葡萄糖，溶解在50mmol／L HAc-NaAc（pH 5.0）缓冲液中，定容至25mL，配制成2mg／mL葡萄糖母液。分别量取葡萄糖母液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL离心管中，加50mmol／L HAc-NaAc补至1.0mL，配制成浓度梯度为0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg／mL的标准溶液，然后每管分别加入DNS（3，5-二硝基水杨酸）2.0 mL，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后于冰浴中迅速冷却，各加入HAc-NaAc缓冲液2mL，振荡混匀，在540nm 处测定光吸收值。以1mL HAc-NaAc缓冲液替代替葡萄糖按同样方法显色作为空白对照，以葡萄糖含量为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y），绘制标准曲线［20］。

1.2.3.2 聚甲基半乳糖醛酸酶提取与活性测定

聚甲基半乳糖醛酸酶提取与活性测定参照薛莲等［21］的方法，采用DNS比色法测定PMG 活性。参照病程曲线下面积（AUDPC）方法计算酶活发展曲线下面积（the area under enzyme activity progress curve，AUEAPC，简称A值），以每个菌株的A值表示其综合活性大小，按如下公式计算A值［22-24］：

式中i为酶活测定次数，n为总测定次数，X为酶活，T为测定时间。

2 结果与分析

2.1 芝麻茎点枯病菌漆酶活性

2.1.1 病原菌产漆酶活性检测

对芝麻茎点枯病菌在含ABTS的PDA平板、含苯胺蓝（azure-B）的BM 平板和对照PDA平板上的生长状况（图1）的观察表明，在对照PDA培养基上的9个菌株菌落形态没有明显差异，菌落呈圆形向外扩展，气生菌丝发达，菌落生长迅速，呈放射状，最初白色、后变为灰色，培养36h左右，在平盘中央形成直径2cm左右的黑色菌核区域，菌核呈密集的点状分布，并快速蔓延，由菌核产生的色素把整个平板染成亮黑色，培养50h左右菌丝长满整个平板；在含有ABTS的PDA培养基上生长时，菌落变成了紫红色。说明9株茎点枯病菌分泌的漆酶氧化了培养基中的ABTS，并且随着培养时间的延长，9株菌的显色直径不断增大，颜色也不断加深；9个菌株对培养基上的苯胺蓝也具有不同程度的脱色作用，说明芝麻茎点枯病菌不仅能够产生漆酶，而且都具有不同程度的降解木质素的能力。09-47由于气生菌丝比较发达，浓密的灰白色气生菌丝掩盖了其下的颜色变化。

图1 平板显色反应法检测芝麻茎点枯病菌漆酶活力Fig.1 Laccase activity in Macrophomina phaseolina determined by plate color reaction

2.1.2 漆酶活性测定

细胞内和细胞外漆酶活性测定结果表明，9株芝麻茎点枯病菌胞内、胞外均有漆酶活性。菌株09-54和2010030胞内漆酶活性低于胞外漆酶活性，其余7株菌胞内漆酶活性均明显高于胞外漆酶活性（表2）。9个菌株中，2010003的胞外酶活力最高，为14.12U／mL；2010028胞内漆酶活性最高，为71.89U／mL，约是其胞外酶活力的13倍。漆酶只有分泌到细胞外才能与作物木质素接触，因此，胞外酶活性的大小与病原菌致病力的大小密切相关，推测菌株2010003侵染芝麻时降解木质素能力最强。

2.2 聚甲基半乳糖醛酸酶活性测定

试验得出葡萄糖标准曲线为x＝（y＋0.100 2）／0.724 2（r2＝0.999 2），根据标准曲线计算PMG 酶活。芝麻茎点枯病菌在活体外均能产生可降解果胶的细胞壁降解酶PMG（图2），在10d内对9株病原菌进行5 次酶活性测定均能检测到PMG 活性，表明在培养过程中病原菌可持续产生果胶酶。菌株2010028、2010077第2天酶活最高；09-54第6天酶活最高；09-26、09-38、2010003、2010004、2010030第8天酶活最高；09-47第10天酶活最高。以AUEAPC为评价指标进行比较（表3），菌株2010003A值最高，极显著地高于其他菌株，菌株09-26的A值最低。A值在一定程度上反映了不同菌株PMG综合活性的大小，也反映了不同菌株降解果胶能力的强弱，进一步推测菌株2010003降解果胶能力最强。

表2 芝麻茎点枯病菌胞内酶、胞外酶差异显著性分析1）Table 2 Analysis of the significant differences of endoenzymes and extracellular enzymes in Macrophomina phaseolina

图2 不同芝麻茎点枯病菌菌株聚甲基半乳糖醛酸酶活性Fig.2 PMG activity comparison between Macrophomina phaseolina strains

表3 不同芝麻茎点枯病菌菌株聚甲基半乳糖醛酸酶的AUEAPCTable 3 The PMG AUEAPC value of Macrophomina phaseolina strains

3 讨论

研究表明9株M.phaseolina菌株均能检测到漆酶活性和PMG 活性，推测这两种酶可能在茎点枯病菌致病过程中起重要作用。M.phaseolina不同菌株之间漆酶活性存在明显差异，并且同一菌株其胞内和胞外的酶活力差异也比较明显。真菌中的漆酶常以同工酶的形式存在［25］。研究中所用培养基组成和培养条件一致，所以9株病原菌产漆酶的水平取决于菌株本身的生长特征和代谢状况，可能其胞内酶与胞外酶的结构不同，因此在致病过程中所起作用也不同。芝麻茎点枯病菌产生果胶降解酶PMG 机制复杂，不但受果胶的诱导，而且还与其上游一系列基因的表达量、调控序列及环境因子等因素有关。只有细胞壁降解酶在寄主体内积累到一定量才会有致病作用，PMG 活性高峰在不同菌株中出现的时间不同，可能会影响病菌侵入寄主的时间。M.phaseolina对芝麻的致病过程是一个复杂的过程，除能产生PMG 和漆酶之外，还会产生其他胞壁降解酶，例如纤维素降解酶，另外还有毒素和激素等致病因子的存在。本研究证实了M.phaseolina能产生漆酶和PMG，菌株2010003胞外漆酶活性以及PMG 的A值均最高。为进一步研究其在寄主活体内的酶活和致病机制奠定了基础。

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