HPLC法测定有柄石韦及华北石韦中绿原酸和木犀草素的含量及不同浸提物的指纹图谱分析

高 贝，程丹丹，辛晓伟，高德民

(山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355)

HPLC法测定有柄石韦及华北石韦中绿原酸和木犀草素的含量及不同浸提物的指纹图谱分析

高 贝，程丹丹，辛晓伟，高德民*

(山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355)

目的:通过HPLC法对有柄石韦及华北石韦中绿原酸和木犀草素含量的测定，以控制石韦药材质量,建立石韦药材中绿原酸及木犀草素的含量测定方法，同时对有柄石韦及华北石韦中绿原酸及木犀草素的含量进行比较以及对不同浸提物的指纹图谱进行分析。方法:用hypersil ODS-2柱,流动相为乙腈-0.5%磷酸水(9 ∶91), 检测波长326 nm，流速1 mL·min-1。结果:各峰可较好的分离，有柄石韦中绿原酸的含量可达到1.51%。结论:该方法操作简便，结果准确，具有较好的重现性与稳定性，可用于有柄石韦及华北石韦中绿原酸和木犀草素含量测定。

HPLC; 有柄石韦；华北石韦; 绿原酸；木犀草素

石韦为水龙骨科(Polypodiaceae)植物庐山石韦[Pyrrosiasheareri(Bak.)Ching]、石韦[Pyrrosialingua(Thunb.) Farwell]和有柄石韦[Pyrrosiapetiolosa(Christ) Ching]的干燥叶[1]。生于裸露干旱岩石上，海拔250～2 200 m。绿原酸具有广泛的生物活性，可以有效清除体内的自由基，具有较强的抑制突变，抗癌，抑菌的作用，能利胆、降压、显著增加胃肠蠕动和促进胃液分泌[2]；木犀草素具有抗肿瘤、抗应变性、抗病毒、抗炎、抗氧化、和保护细胞的作用，对白血病细胞、肿瘤细胞和神经元细胞生物学功能有影响[3]。华北石韦未被药典收录到石韦药材中，HPLC为药典规定的石韦中绿原酸含量测定方法。本研究主要采用高效液相色谱法对两种石韦中绿原酸和木犀草素的含量测定，以期为药用石韦扩大资源，合理开发利用，控制药材质量及进一步化学研究提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 主要试药

对照品绿原酸(上海金穗生物科技有限公司；20130916)，木犀草素(上海金穗生物科技有限公司；20131021)乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。 有柄石韦，华北石韦(采自胶东，2013.09.06)经高德民副教授鉴定，保存于山东中医药大学标本馆。

1.2 仪器

浙大智达N2000高效液相色谱仪(浙江大学智达信息工程有限公司)；万分之一分析天平(上海菁海仪器有限公司)

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱 Shim-pack VP-ODS (4.6 mm×250 mm，5μm);流动相为乙腈-0.5% 磷酸水(9 ∶91);检测波长0～45 min 为 326 nm，流速为 1.0 mL·min；柱温为 25 ℃[1，8]。

2.2 溶液的制备[1]

2.2.1 对照品溶液的制备[4,5]

精密称取绿原酸、木犀草素对照品各5 mg，加 50%甲醇溶解,分别制成 0.5,0.25 mg·mL-1的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

精密称取有柄石韦及华北石韦粉末(过2号筛)1 g,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇40 mL,密塞,称重,超声处理45 min,取出,放冷,再称重,用50%甲醇补足失重,摇匀,滤过,取续滤液,即得，备用。精密称取有柄石韦粉末1 g,按以上方法，制备水，甲醇，乙醇(50%)，丙酮浸提物[6-7]。

2.3 线性关系考察试验

分别精密量取上述绿原酸，木犀草素对照品溶液2,5,10,15,20μL进样[8]，以色谱峰面积(Y)对质量(X)进行回归，木犀草素的线性回归方程为Y=3 634 201X+26 587，r=0.999 9，线性范围为0.029 7～0.42 μg。绿原酸的线性回归方程为Y=25 089X+840 462，r=0.999 8，线性范围为0.018～0.89 μg。

2.4 精密度试验

取上述对照品溶液20 μL，连续进样5次，测得木犀草素的峰面积RSD为0.75%，绿原酸的峰面积RSD为0.45%，表明仪器进样精密度良好[9-10]。

2.5 稳定性试验取

取上述对照品溶液20 μL分别在0、2、4、6、8、12 h进样，测定木犀草素的峰面积RSD为1.98%，绿原酸的峰面积RSD为0.87%表明样品溶液在12 h内稳定[11]。

2.6 重现性试验

取同批有柄石韦及华北药材，按供试品制备方法配制6份，分别进样20 μL，测定木犀草素，绿原酸的峰而积RSD分别为1.98%，1,69%，表明该方法的重现性较好[12]。

2.7 样品测定

按上述待测溶液的制备方法制备溶液,按绿原酸和木犀草素测定色谱条件,对待测样品进行测定[1],外标法计算含量，得到回归方程为：绿原酸Y=25 089X+840 462,r=0.999 0;木犀草素Y=11 651X+10r=0.999 7。利用面积归一化法对1～8号物质进行相对含量测定。

2.8 结果

图1 有柄石韦(A)、华北石韦(B)、对照品(C)、阴性对照(D)的HPLC指纹图谱

图2 有柄石韦水(A)，甲醇(B)，乙醇(50%)(C),丙酮(D)浸出物HPLC指纹图谱

表1 有柄石韦、华北石韦中绿原酸及木犀草素的含量

图3 有柄石韦不同浸出物中各峰处物质的相对含量

2.8.1 结果分析

有HPLC指纹图谱可知各峰分离效果较好,与相邻峰能达到基线分离,无重叠峰,R>2.0,保留时间合适,稳定,重现性好。

2.8.2 验证试验

按照实验条件进行多次实验，以验证该工艺的精密性，可重复性和稳定性，结果无显著差异，结果精密度良好，方法稳定，准确，可靠。

3 讨 论

结果表明有柄石韦和华北石韦所含化学成分的种类基本相似，但各成分的含量有很大差异。HPLC指纹图谱分离度较好(图1)，稳定可靠,建立了石韦中绿原酸与木犀草素的HPLC测定方法。可作为石韦近似种的鉴别及进一步的成分研究提供基础材料。有柄石韦和华北石韦中绿原酸的含量均达到药典要求(不得少于0.20%)，有柄石韦中绿原酸的含量明显高于华北石韦，但木犀草素的含量明显低于华北石韦(表1)。单从绿原酸含量可以考虑将其归入药用石韦，但仍需做进一步的药效，药理及临床实验。这为中药石韦的深入开发研究提供参考，也为药材鉴别提供了科学依据[13-14]。

有柄石韦不同浸提物中的成分及含量存在很大差异，化合物1在甲醇和乙醇浸提物中含量较高，5，6在丙酮，8在水提物中相对含量较高，2, 5在水提物中相对含量较少，4在乙醇提取物中的含量最低，在其它提取物中相差不大，7在各提取物中所咱的相对含量没有明显差别(图2，3)。这为进一步有柄石韦的提取，分离及有效成分分析提供基础材料[15]，也为石韦药材的质量控制提供科学依据。

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Determination of Chlorogenic Acid and Mignonette inPyrrosiapetiolosa(Christ) Ching andPyrrosiadavidii(Baker) Ching by HPLC andAnalysis of Fingerprints from Different Extraction

Gao Bei, Cheng Dandan, Xin Xiaowei, Gao Demin

(School of Pharmacy, Shandong University of TCM, Jinan 250355, China)

Objective:HPLC method for simultaneous determination of chlorogenic acid and mignonette inPyrrosiapetiolosa(Christ) Ching andPyrrosiadavidii(Baker) Ching，for quality control, establish the content determination method and the comparison in content of chlorogenic acid and mignonette inPyrrosiapetiolosa(Christ) Ching andPyrrosiadavidii(Baker) Ching, at the same time, analyze fingerprints from different extraction.Method:With ODS-C18column, mobile phase acetonitrile-phosphate (0.5% ) (9:91), wavelength 326 nm, flow rate 1 mL·min-1.Results:The peaks can be good separated, the content of chlorogenic acid can reach 1.51% inPyrrosiapetiolosa(Christ) Ching.Conclusion:The method is simple and good reproducibility, and can be used for determination of chlorogenic acid and mignonette inPyrrosiapetiolosa(Christ) Ching andPyrrosiadavidii(Baker) Ching.

HPLC;Pyrrosiapetiolosa(Christ) Ching；Pyrrosiadavidii(Baker) Ching; chlorogenic acid； mignonette

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.01.006

2014-07-12

山东中医药大学2012年SRT资助项目。

R284.1

A

1006-9690(2015)01-0019-03