甲磺酸帕珠沙星对临床常见致病菌体外抗菌活性及抗生素后效应观察

黄培池

甲磺酸帕珠沙星(Pazufloxacin Mesilate)是第三代氟喹诺酮类抗生素。甲磺酸帕珠沙星是一种广谱抗菌药物，在体内外均表现出很强的抗菌活性，目前，广泛适用于革兰阳性菌及革兰阴性菌的感染。本实验通过测定甲磺酸帕珠沙星对临床常见致病菌的最低抑菌浓度，观察其抗菌活性，进而研究对大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌的抗生素后效应，为临床合理用药，设计最佳给药方案提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药品与试剂 甲磺酸帕珠沙星:含量99.5%，效价76.84%，批号20140310(江苏豪森制药集团提供);左氧氟沙星(对照药物):含量97.2%，样品号130455 –200202，中国药品生物制品检定所提供;水解酪蛋白(MH)琼脂(批号20131112)，营养肉汤(批号20131008)，均由杭州天和微生物试剂有限公司生产;1% 氯化三苯四氮唑(TTC):(批号821218，北京化工厂生产)。

1.1.2 菌株 205 株临床致病菌由徐州市第四人民医院呼吸科和泌尿科自患者尿液或痰中分离培养所得，其中包括肺炎克雷伯菌27 株、其他克雷伯菌2 株、肠杆菌属6 株、表皮葡萄球菌10 株、葡萄球菌属10 株、粪肠球菌5 株、铜绿假单胞菌11 株、其他假单胞菌3 株、阴沟肠杆菌13 株、不动杆菌属13株、枸橼酸杆菌2 株、链球菌属6 株、流感嗜血杆菌14 株。三株标准菌大肠埃希氏菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、铜绿假单胞菌ATCC 27853 均由中国药品生物制品检定所提供;测定PAE 所用的大肠埃希氏菌由徐州市第四人民医院泌尿科自患者尿液中分离培养所得，肺炎克雷伯氏菌由徐州市中医院呼吸科自患者痰中分离培养所得。

1.1.3 仪器 MIT – P 型多点接种仪;TN－100B 型托盘式扭力天平;LS– B35L 型立式压力蒸汽灭菌器;微量进样器;GNP–9160 型隔水恒温培养箱;PW/10 –002 型台式保温培养箱;XW–80A 型旋涡混合器;MA110 型电子分析天平。

1.2 实验方法

1.2.1 最低抑菌浓度(MIC)的测定 采用琼脂稀释法。

1.2.1.1 琼脂平板的制备 用托盘式扭力天平称取琼脂30.4 g，按38 g/1000 ml 的比例，在三角瓶中用800 ml 纯化水配成琼脂溶液，将其置于压力蒸汽灭菌器中120℃灭菌20 min后，取出备用，在无菌条件下，将其倒入平皿中，每皿20 ml。其中，血琼脂平板按特定方法制备。待琼脂凝固后，翻转，备用。

1.2.1.2 增菌 将琼脂平板按放射状平均分成8 份，按细菌增菌清单标记平板，使用接种环将测试菌接种在对应区域中，每皿接种8 株不同菌落。其中，流血嗜血杆菌和链球菌要接种在血琼脂平板上。接种完毕后，将其倒置于37℃恒温培养箱中培养18 h，备用。

1.2.1.3 抗菌药液的制备 在无菌条件下，精密配制浓度为5 120 μg/ml 的抗菌药液，将其依次进行二倍稀释，分别得到2 560 μg/ml、1 280 μg/ml、640 μg/ml、320 μg/ml、160 μg/ml、80 μg/ml、40 μg/ml、20 μg/ml、10 μg/ml、5 μg/ml、2.5 μg/ml、

1.25 μg/ml、0.6 μg/ml、0.3 μg/ml、0.16 μg/ml 系列浓度的抗菌药液。

1.2.1.4 含药琼脂平板的制备 在已经作好标记的灭菌培养皿中加入对应浓度的抗菌药液1 ml，再取经121℃20 min 灭菌的MH 琼脂溶液19 ml，加入到每个培养皿内，边加边摇晃培养皿，使药物和培养基充分混匀，即得含药琼脂平板，此时药物浓度分别为256 μg/ml、128 μg/ml、64 μg/ml、32 μg/ml、16 μg/ml、8 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml、0.5 μg/ml、0.25 μg/ml、0.125 μg/ml、0.06 μg/ml、0.03 μg/ml、0.016 μg/ml、0.008 μg/ml。以上操作均在无菌条件下进行。

1.2.1.5 接种和判读 按细菌接种清单排列接种细菌的顺序，并将含有药液的培养皿按组摆放整齐。取灭菌好的小玻璃试管27 只按照细菌的接种清单对其进行标号，置于试管架上。每只试管中加入灭菌生理盐水1 ml，用接种环挑取细菌少许，置于1 ml 的灭菌生理盐水中，振荡，使其分散均匀，用0.5 麦氏比浊管校正浊度，使菌液浓度为108 cfu/ml。然后，连接电源(变压器电源为100V)，安装接种棒。将盛有校正好浊度的菌液试管，按照顺序放入接种盘中，将接种好的培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养18 h 后，判读结果，以无菌落生长的最低药液浓度为该药对待测菌的最低抑菌浓度。

1.2.1.6 质量控制 分别选用大肠埃希氏菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、铜绿假单胞菌ATCC 27853 标准菌株，在同一实验条件下测定MIC，对整个实验过程进行质量控制。

1.2.2 抗生素后效应(PAE)的测定

1.2.2.1 抗菌药物溶液的制备 在无菌条件下，将精密称取的甲磺酸帕珠沙星10.7 mg，溶解到10 ml 灭菌生理盐水中，配制成16 MIC×6400 倍的抗菌药物溶液后(待测菌的MIC 值为0.008 ug/ml)，再分别用灭菌生理盐水稀释成16 MIC、8 MIC 和4 MIC 的抗菌药物溶液，备用。

1.2.2.2 PAE 的测定 挑取4～6 个待测菌的单一菌落，接种于10 ml 营养肉汤中，37℃培养箱中孵育8～12 h 后，取该菌液2 ml 加入到18 ml 营养肉汤中，用0.5 麦氏比浊管校正浊度，使菌液浓度为108 cfu/ml。再将其进行50 倍稀释后，分别取1 ml 该菌液加入到已编号为T、C1、C2、C3 的4 支试管中，在实验管T 中加入1 ml 16 MIC 的抗菌药液，对照管C1 和对照管C2 中分别加入1 ml 灭菌生理盐水，对照管C3 中加入1 ml 16 MIC 的抗菌药液(作为抗菌药持续作用对照)，使4 支试管中菌液浓度均为106 cfu/ml，T 和C3 药液浓度为8 MIC。将4 支试管置于37℃培养箱中孵育1.5 h 后，用营养肉汤分别对T、C1、C2 管中的培养液进行1000 倍稀释祛除药物，并在C2 管中加入抗菌药物，其浓度为T 管中被稀释后的药物浓度，作为残余药物造成后效应的证明对照，确定此时为测定PAE 的零点，然后置于37℃培养箱中继续孵育，在孵育的0、1、2、3、4、5、6、7 h，分别吸取各管中培养液进行一定倍数稀释，然后吸取稀释液25 μl，均匀涂布于含有TTC 的琼脂平板上，倒置于37℃培养箱中孵育18 h 后，进行菌落计数。该实验过程重复3 次取其平均值，根据稀释度计算cfu/ml，以孵育时间为横坐标，以活菌数cfu/ml 的对数为纵坐标，应用计算机Microsoft Excel 2000 软件绘制细菌生长曲线。以同法测定药物浓度为4 MIC、2 MIC 时甲磺酸帕珠沙星对大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌的PAE。

1.2.2.3 PAE 的计算 PAE 为与药物作用过的细菌和未与药物作用过的细菌各自活菌数增加一个对数单位所需的时间差，即以培养液被稀释后T 管中细菌增殖一个对数单位所需的时间减去C1 管中细菌增殖一个对数单位所需的时间。

PAE(h)=T－C1

T 和C1分别为实验管和对照管1 中细菌各自增加一个对数值(10 倍)所需的时间，通过细菌生长动力学曲线求出。

2 结果

2.1 甲磺酸帕珠沙星和左氧氟沙星对MICI 测定结果 见表1、表2。

2.2 不同浓度甲磺酸帕珠沙星对大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌的PAE 值 见表3。

表1 甲磺酸帕珠沙星MIC 测定值结果分析(μg/ml)

表2 左氧氟沙星MIC 测定值结果分析(μg/ml)

表3 大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌的PAE 值(h)

3 讨论

甲磺酸帕珠沙星是一种抗菌谱广，抗菌作用强，对多数革兰阳性菌及革兰阴性菌有较好抗菌作用的氟喹诺酮类药物，本实验结果也表明，甲磺酸帕珠沙星对各种不同临床常见致病菌的抗菌活性均较强，尤其对肺炎克雷伯氏菌，其MIC50 和MIC90 分别为≤0.008 μg/ml、0.016 μg/ml;另外，阴沟肠杆菌对甲磺酸帕珠沙星也比较敏感。

本实验研究结果也表明，甲磺酸帕珠沙星对大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌均存在明显的PAE，且随着药物浓度的增大，PAE 值随之增大。大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌对甲磺酸帕珠沙星存在浓度依赖性，且药物对大肠埃希氏菌的PAE 明显长于肺炎克雷伯氏菌，尽管甲磺酸帕珠沙星对大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌的MIC 相同，所以，在临床使用甲磺酸帕珠沙星时，对大肠埃希氏菌引起的感染，用药间隔要长于肺炎克雷伯氏菌引起的感染。

近年来，在国内外抗感染药物研究领域开始受到关注的新理论，是抗菌药物对细菌特有的效应，对PAE 的研究可提供抗菌药效动力学指标，同时更新传统的要求血药浓度持续高于有效浓度给药方案的设计思想。由于PAE 反映了抗菌药清除后或浓度大大低于MIC 时细菌仍受到抑制，因此对有明显PAE 且毒性较低的药物，在不影响疗效的同时，可减少用药次数和提高单次给药量，这样不仅方便用药，而且还可降低药物的不良反应和费用，保持或提高疗效。

［1］杨信怡，游雪甫.注射用帕珠沙星的药理研究和临床应用［J］.国外医药·抗生素分册，2003，24(2):80-87.

［2］王 睿，方 翼，杜丽华，等.4 种头孢菌素的抗生素后效应影响因素［J］.中国临床药学杂志，1998，7(2):77-79.

［3］王 睿，薛俊峰，方 翼，等.格帕沙星与氧氟沙星体外抗生素后效应研究［J］.2005，30(2):111-113.