霍乱弧菌DncV蛋白的原核表达及活性分析

韩莹倩，孔江南，王 江，张 超，杨国宇

(河南农业大学农业部动物生化与营养重点开放实验室，郑州 450002)

霍乱弧菌DncV蛋白的原核表达及活性分析

韩莹倩，孔江南，王 江，张 超，杨国宇*

(河南农业大学农业部动物生化与营养重点开放实验室，郑州 450002)

DncV(VC0179)是在霍乱弧菌中发现的一种双核苷酸环化酶，其可以合成c-di-AMP、c-di-GMP和c-GAMP。研究发现c-di-GMP作为胞内的第二信使，通过STING信号通路激活先天性免疫应答。为了体外制备c-di-GMP用于深入研究其功能，构建了VC0179融合cherry标签的丙酸诱导型表达载体，并将该重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。利用丙酸钠诱导表达后，观察菌体颜色是否为红色判断融合蛋白质的表达。超声破碎细菌后经SDS-PAGE电泳检测融合蛋白质的可溶性表达。最后通过Ni-NTA Agarose亲和纯化重组蛋白质，获得的重组蛋白质进行体外酶促反应，高效液相色谱检测合成产物c-di-GMP。结果表明：成功构建VC0179丙酸诱导型原核表达载体并获得了高纯度的VC0179重组蛋白质。该重组蛋白质通过体外酶促反应可一步生成c-di-GMP。本试验建立了稳定获得具有酶活性的VC0179重组蛋白质的方法；c-di-GMP的体外合成为其后续功能研究及大量制备奠定基础。

VC0179；c-di-GMP；原核表达；酶促合成法；高效液相色谱

DncV(VC0179)是在霍乱弧菌中发现的一种催化合成c-di-AMP、c-di-GMP、c-GAMP双核苷酸环化酶[1]。其合成产物c-di-AMP与c-di-GMP作为胞内的第二信使可调节细菌体内的多种应答[2]。19世纪90年代，人们首次发现c-di-GMP对醋酸纤维杆菌的生物膜形成具有重要的调节作用，是一种新型纤维素合成酶变构调节因子[3-4]。此外，c-di-GMP在细胞周期、生长发育、菌毛生成、Ⅲ型分泌系统、RNA调节、压力应激、细菌捕食、毒力等多方面发挥调控作用[2，5-6]。在哺乳动物细胞的研究中发现，c-di-GMP、c-GAMP作为胞内的第二信使，可直接与STING相互作用激活干扰素效应模式识别系统，诱导Ⅰ型干扰素的表达[7-9]。鉴于VC0179合成产物在生物体中的重要功能，本试验构建了VC0179丙酸诱导型原核表达载体，并对其进行表达分析与纯化，获得高纯度的VC0179靶蛋白。体外一步法合成c-di-GMP为进一步功能研究及免疫增强剂c-di-GMP产品的制备奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂材料

质粒小量快速提取试剂盒、胶回收试剂盒及PCR纯化试剂盒均购自生工生物工程(上海)有限公司；Ni-NTA Agarose购自Qiagen公司；T4连接酶、限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ均购自英国NEB公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所；GTP标准品购于Aladdin公司；c-di-GMP标准品购于Invivogen公司；4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、乙酸铵和MgCl2购于Sigma公司；色谱甲醇购于Fisher公司；E.coilDH5α、E.coilBL21(DE3)感受态细胞和TEV酶均为本室保存；含全长VC0179重组质粒pMD19-VC0179及含His和cherry标签的丙酸诱导型载体由本室构建保存。

1.2 表达载体的构建及鉴定

用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pMD19-VC0179，获得VC0179目的片段的全长。用T4连接酶将其与同样酶切处理的丙酸诱导型载体连接，连接产物转化E.coilDH5α。转化菌液涂布于含氨苄青霉素(100 mg·mL-1) LB平板，37 ℃倒置培养过夜。挑选阳性克隆，用BamHⅠ和XhoⅠ酶切验证后，送往生工生物工程(上海)有限公司测序鉴定。

1.3 重组蛋白质的诱导表达及可溶性鉴定

将测序正确的重组质粒转化至E.coilBL21(DE3)。在含Amp的LB平板上挑取含重组质粒的单个菌落，接种于含100 mg·mL-1Amp的2 mL LB液体培养基中，37 ℃培养过夜。将得到的菌液按体积比1∶100接种于含100 mg·mL-1Amp的100 mL LB液体培养基中，37 ℃、220 r·min-1振荡培养至OD600 nm达0.6，将菌液分两等份，一瓶加入20 mmol·L-1的丙酸钠，室温过夜诱导表达，另外一瓶作为空白对照不加诱导剂室温过夜摇菌。次日各吸取1 mL，离心去上清，加PBS重悬，加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液混匀，沸水煮10 min。剩余的菌液离心收集沉淀，10 mL PBS重悬菌体，加溶菌酶(1 mol·L-1)冰浴30 min后，低温超声波破碎菌体(超声时间4 s，间歇7 s，100次)。分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。

1.4 重组蛋白质的纯化与酶切

将诱导成功的阳性重组菌液接种于2 mL LB(含Amp)培养液中，37 ℃、220 r·min-1振荡培养过夜。次日取1 mL菌液接种于100 mL LB(含Amp)培养基中，37 °C振荡培养至OD600 nm为0.6，加入终浓度为20 mmol·L-1的丙酸钠，室温、180 r·min-1诱导过夜。离心收集菌体细胞，加10 mL Lysis buffer重悬，加溶菌酶(1 mg·mL-1)混匀后冰浴30 min，低温超声破碎。破碎后低温离心30 min，取40 μL上清制备SDS-PAGE分析样品。剩余的上清液加到预前处理好的Ni-NTA，4 °C 200 r·min-1结合60 min，将上清-Ni-NTA混合物分为2份，一份用5倍体积的Wash buffer洗3次，最后用0.5 mL Elution buffer洗脱靶蛋白4次，收集4次的洗脱液。另外一份直接加入2 mL Wash buffer(含TEV酶) 4 °C振荡酶切过夜，次日低速离心取上清。分别吸取40 μL的洗脱液及TEV酶切后的上清液，加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液混匀，沸水煮10 min，-20 °C保存。

1.5 c-di-GMP的合成及鉴定

1.5.1 标准品及底物溶液的配制 精确称取一定量c-di-GMP及GTP，用水溶解配成质量浓度为20 μg·mL-1的标准品溶液及100 mmol·L-1的底物溶液。

1.5.2 c-di-GMP的合成 纯化的VC0179重组蛋白通过BCA蛋白浓度测定后，取1.2 μmol·L-1VC0179与2 mmol·L-1的GTP在含5 mmol·L-1MgCl2和20 mmol·L-1HEPES的缓冲液中37 ℃反应2 h。

1.5.3 液相色谱条件 Venusil XBP C18(L)色谱柱(5 μmol·L-1，250×4.6 mm，Agela)；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL·min-1；进样量：5 μL；柱温：25 ℃。流动相：乙酸铵(A)-甲醇(B)，采用线性梯度洗脱：流动相在45 min之内从95% A+5% B逐渐降至50% A + 50% B。

2 结 果

2.1 重组表达载体的构建及鉴定

酶切获取VC0179和丙酸诱导型载体的线性片段(图1 A)，连接转化后挑取阳性菌落双酶切鉴定，结果与预期相符(图1 B)。阳性克隆测序结果显示重组质粒构建成功。

2.2 重组蛋白质的诱导表达及可溶性鉴定

重组质粒转化至E.coilBL21(DE3)，20 mmol·L-1丙酸钠室温诱导过夜。取2 mL菌液离心后观察菌体为红色。超声破碎诱导后菌体分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE结果显示诱导后的全菌和上清样品在72 ku处均有一明显的条带(图2)。结果表明，成功诱导表达重组蛋白且为可溶性表达。

M.5 000 bp DNA相对分子质量标准；1.pMD-19-VC0179酶切后的片段(目的片段为小片段)；2.pMD-19-VC0179原质粒；3.丙酸诱导型载体酶切后的片段(目的片段为大片段)；4.丙酸诱导型载体原质粒；5～8.重组质粒M.DL5000 DNA marker；1.Product of pMD-19-VC0179 digested by BamHⅠ and XhoⅠ(The target fragment is the shorter one)；2.Plasmid of pMD-19-VC0179；3.Product of propionate-inducible vector digested by BamHⅠ and XhoⅠ (The target fragment is the larger one)；4.Plasmid of propionate-inducible vector；5-8.Recombinant plasmids图1 酶切获取VC0179与丙酸诱导型载体线性片段及重组质粒BamHⅠ和XhoⅠ酶切鉴定Fig.1 Target fragment of VC0179 and propionate-inducible vector by restriction enzyme and identification of recombinant plasmid digested by BamHⅠ and XhoⅠ

M.蛋白质相对分子质量标准；1.未诱导的重组质粒BL21(DE3) 菌总蛋白质；2.诱导后的重组质粒BL21(DE3) 菌总蛋白质；3.诱导后的重组质粒BL21(DE3) 菌超声破碎的上清液；4.诱导后的重组质粒BL21(DE3) 菌超声破碎的沉淀；5.未诱导的重组质粒BL21(DE3) 菌超声破碎的上清液；6.未诱导的重组质粒BL21(DE3) 菌超声破碎的沉淀M.Protein molecular weight marker；1.Total protein of uninduced BL21(DE3) with recombinant plasmid；2.Total protein of induced BL21(DE3) with recombinant plasmid by propionate；3.Supernatant after ultrasonic of induced BL21(DE3) with recombinant plasmid by propionate；4.Inclusion after ultrasonic of induced BL21(DE3) with recombinant plasmid by propionate；5.Supernatant after ultrasonic of uninduced BL21(DE3) with recombinant plasmid；6.Inclusion after ultrasonic of uninduced BL21(DE3) with recombinant plasmid图2 VC0179重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the recombinant VC0179 expression in E.coli BL21(DE3)

2.3 重组蛋白质的纯化与酶切

取处理好的各个样品10 μL，经12% SDS-PAGE电泳(图3)。考马斯亮蓝染色结果显示，纯化后获得较高纯度的重组蛋白质，TEV酶成功切除重组蛋白质中的融合标签，获得VC0179靶蛋白。

2.4 c-di-GMP的合成及鉴定

高效液相色谱生成报告显示(图4)：VC0179重组蛋白体外酶促反应生成产物的出峰时间与c-di-GMP标准品出峰时间一致。结果表明本试验所获得的重组蛋白质具有功能活性，可在体外一步法生成c-di-GMP。

3 讨 论

VC0179是人们发现的首个可以在革兰阴性菌中合成c-di-AMP、c-di-GMP、c-GAMP的一种新型的双核苷酸环化酶[1]。VC0179作为环化酶可有效促进霍乱弧菌的肠道定殖，同时还可调节趋化性的细菌定殖[1]。随后的研究发现，真核细胞在转染dsDNA或DNA病毒侵染后也可生成c-GAMP，c-GAMP与STING结合后活化TBK1-IRF3信号通路介导Ⅰ型干扰素应答[10]。c-di-GMP也可通过该信号通路诱导Ⅰ型干扰素表达[11]。研究证实c-di-GMP可作为一种疫苗佐剂促进黏膜途径的免疫[12-13]。鉴于VC0179的合成产物在先天性免疫中的重要功能，本试验构建了VC0179原核表达载体对其进行表达及纯化，旨于建立一种稳定获得可溶性表达的有活性的VC0179重组蛋白的方法，进而用于体外酶促反应研究。

M.蛋白质相对分子质量标准；1.诱导前重组质粒BL21(DE3) 菌总蛋白质；2.诱导后重组质粒BL21(DE3) 菌总蛋白质；3.诱导后重组质粒BL21(DE3) 菌超声破碎的上清液；4.纯化的重组蛋白质；5.TEV酶切后的VC0179蛋白M.Protein molecular weight marker；1.Total protein of BL21(DE3) with recombinant plasmid before induction；2.Total protein of induced BL21(DE3) with recombinant plasmid by propionate；3.Supernatant after ultrasonic of induced BL21(DE3) with recombinant VC0179 plasmid by propionate；4.Puried recombinant protein；5.VC0179 protein after TEV cleavage图3 纯化及TEV酶切后VC0179重组蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of purification and TEV cleavage of VC0179 recombinant protein

本试验构建的VC0179原核表达载体可使重组蛋白在E.coil中大量廉价表达，便于分离纯化，避免了对包涵体变性复性处理，为纯化保持VC0179活性提供保证。本试验虽然成功获得c-di-GMP，但最佳的合成条件还需进一步摸索以提高GTP的利用率及产量。B.W.Davies等[1]曾用RPHPLC、LCMS、MS/MS、变性凝胶电泳等多种方法检测VC0179的体外合成产物c-di-AMP、c-di-GMP及c-GAMP。本试验仅用高效液相色谱法检测VC0179体外合成产物，更加简便低成本的检测手段还有待进一步研究。

图4 高效液相色谱Fig.4 Chromatograms of high performance liquid chromatography

4 结 论

成功构建VC0179丙酸诱导型原核表达载体，并建立获得有活性VC0179重组蛋白的方法。c-di-GMP的体外合成为后续c-di-GMP功能研究奠定基础。

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(编辑 白永平)

Prokaryotic Expression and Activity Analysis of DncV fromVibrioCholera

HAN Ying-qian，KONG Jiang-nan，WANG Jiang，ZHANG Chao，YANG Guo-yu*

(KeyLaboratoryofAnimalBiochemistryandNutrition，MinistryofAgriculture，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China)

DncV(VC0179) is the member of a new family of di-nucleotide cyclases inVibriocholeraand it can catalyzes the synthesis of c-di-AMP，c-di-GMP and c-GAMP.c-di-GMP serves as the second messenger molecule to activate the innate immunity through STING signaling pathway.To generate c-di-GMP in vitro and further investigate its functions，we constructed the propionate-inducible VC0179 prokaryotic expression plasmid fused with cherry-Tag.The recombinant plasmid was transformed intoE.coilBL21(DE3) and induced by propionate.The expression of recombinant protein was observed by red color.SDS-PAGE analysis was used to identify the soluble expression of recombinant protein after ultrasonic decomposition.Moreover，c-di-GMP was enzymatically synthesizedinvitrowith the recombinant protein purified by Ni-NTA purification system and detected by high performance liquid chromatography.We successfully constructed the propionate-inducible VC0179 prokaryotic expression plasmid and acquired the high quality fusion protein，which could catalyze the synthesis of c-di-GMPinvitroby a one-step process.These results suggested that we established a method to generate enzymatically active VC0179 recombinant protein.The synthesis of c-di-GMPinvitrocould facilitate the functional study and high volume production of c-di-GMP.

VC0179；c-di-GMP；prokaryotic expression；enzymatic synthesis；high performance liquid chromatography

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.026

2014-09-09

农业部948重点计划(2011-G35)；河南省重点科技攻关(112102310705)

韩莹倩(1990-)，女，蒙古族，内蒙古呼伦贝尔人，硕士生，主要从事动物生物技术研究，E-mail：twgjl@163.com

*通信作者：杨国宇，教授，博士生导师，E-mail：haubiochem@163.com

S852.61

A

0366-6964(2015)05-0868-05