关岭牛MyoDI基因启动子真核表达载体的构建及其在小鼠C2C12细胞中的表达

桓聪聪，许厚强，陈 伟，陈 祥，赵佳福，张 雯，周 迪，夏 丹

(1.贵州大学生命科学学院，贵阳 550025；2.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室/贵州大学动物科学学院/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵阳 550025)

关岭牛MyoDI基因启动子真核表达载体的构建及其在小鼠C2C12细胞中的表达

桓聪聪1，2，许厚强2*，陈 伟1，2，陈 祥2，赵佳福2，张 雯2，周 迪2，夏 丹2

(1.贵州大学生命科学学院，贵阳 550025；2.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室/贵州大学动物科学学院/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵阳 550025)

本研究旨在探究关岭牛4个不同长度的MyoDI启动子的启动活性，初步确定该基因核心启动子位置。采用实时荧光定量PCR技术对关岭牛不同组织中MyoDI基因的相对表达量进行检测。以关岭牛血液DNA为模板，设计5'端加磷的引物，PCR扩增获得4个不同长度的关岭牛MyoDI启动子，定向精确替换pEGFP-N3载体的CMV启动子区，构建重组真核表达载体pEGFP-N3-MyoDI。利用脂质体法将重组质粒瞬时转染小鼠C2C12细胞，依据小鼠C2C12细胞发光的强弱判断MyoDI启动子的启动活性。结果显示，MyoDI基因在关岭牛肌肉组织中表达量较高；目的片段成功替换pEGFP-N3载体的CMV区；重组质粒能在小鼠C2C12细胞中成功表达，细胞在激发光下发绿色荧光。本研究成功构建了重组真核表达载体pEGFP-N3-MyoDI，4个启动子均具有启动活性，其中P3启动子在小鼠C2C12细胞中表达量最高，初步推断P3启动子为该基因的核心启动子。

MyoDI；真核表达载体；C2C12细胞；启动子；基因表达量

启动子是位于基因5′端上游转录起始位点附近的一段DNA序列，根据基因表达情况，可分为组成型启动子和特异性启动子，前者在各种组织中均能启动基因表达，后者仅在一定发育时期的特定组织中启动基因表达，肌肉特异性启动子在肌肉组织内能够高效地表达外源基因，但在非肌肉组织内的启动效率很低[1-2]。近年来，国内外学者对肌肉特异性启动子的转录活性及其对肌肉细胞增殖和分化的作用进行了深入研究[3]，但是由于肌肉细胞的分化特性和多种肌肉特异性启动子只在终末分化的肌肉细胞内才能启动基因表达，所以在体外培养的肌源性干细胞内的启动效率很低，给肌肉机理研究带来困难[4-5]。

生肌调节因子家族(Myogenic regulatory factors，MRFs)，也称生肌决定因子家族(MDFS)，骨骼肌表达的生肌调节因子称为MyoD基因家族[6]。MyoD基因家族包括4种结构上相关的基因：MyoDI、MyoG、Myf5和MRF4[7-8]，它们对生肌发生起重要调节作用，可使成纤维细胞、成软骨细胞和平滑肌细胞向骨骼肌细胞分化，影响家畜肌肉的生长。这些基因编码碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)蛋白，通过调节肌肉分化阶段特异性蛋白的表达来参与肌细胞定向和分化。Myf5和MyoDI在成肌细胞增殖过程中表达，Myf5基因所起的作用基本能够被MyoDI基因替代，二者的功能有许多相似的特征[9-11]。MRFs家族成员的表达时间和功能特点对于骨骼肌的发生、分化和成熟起着重要作用。MyoDI和Myf5基因主要在骨骼肌发育早期的肌前体细胞向成肌细胞分化的过程中发挥作用，而MyoG和MRF4基因主要在骨骼肌发育晚期的成肌细胞向终末骨骼肌纤维细胞分化的过程中发挥作用[12-15]。

MyoDI(Myogenic differentiation Ⅰ)基因启动子为组织特异性启动子[16]，是骨骼肌生长发育过程中重要的正调控基因。在形成肌肉特异基因转录调控中，MyoDI起着总开关的作用，可以结合到肌细胞生成素、肌酸激酶CK、肌球蛋白、结蛋白等基因启动子区发挥重要调控作用，促进它们的转录激活[17-18]。肌分化因子MyoD原名MyoDI，1987年被首次克隆[19]。现已知牛的MyoDI位于15号染色体，为2 648 bp，有3个外显子。MyoDI基因产物参与多种分化细胞向肌细胞转化，可影响肌肉结构的表达。近年来，MyoDI基因已经成为动物肉质改良育种的重要研究部分[20-21]。目前在国内外，该基因在小鼠、鸡和猪肌细胞生成的表达调控机制方面报道较多；在牛方面主要集中在转录和翻译水平的研究，而对MyoDI基因的表达调控和MyoDI基因启动子的功能和调控方面的研究较少[22]。田璐等在3个黄牛品种及4个杂交肉牛群体MyoD基因多态性的研究中发现其显著影响肉牛多个肉质性状[23]，由此可见，研究MyoDI基因启动子有着十分重要的意义。李飞等已经证实MyoDI基因启动子为肌肉组织特异性启动子[24]，但对MyoDI基因启动子的活性以及核心启动子位置并没有进行详细的研究。

本研究采用荧光定量PCR技术(QRT-PCR)对MyoDI基因进行了差异表达分析；克隆关岭牛MyoDI基因4段启动子区，成功构建pEGFP-N3-MyoDI真核表达载体；通过转染小鼠C2C12细胞，观察C2C12细胞的荧光强度进一步确定MyoDI基因启动子的活性及核心启动子位置，同时为进一步构建MyoDI启动子转基因小鼠模型奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

E.coliDH5α感受态细胞、TransStart®Green qPCR SuperMix UDG、TransStart®One-Step gDNA Removal and cDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 反转录试剂盒、血液基因组DNA提取试剂盒、柱式质粒DNA抽提试剂盒、柱式DNA胶回收试剂盒购于上海生工生物工程技术服务有限公司；真核表达载体pEGFP-N3、限制性内切酶SacI、Hind III、T4DNA连接酶、DNA marker均购于TaKaRa公司；高保真DNA聚合酶，dNTP购于鼎国公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清购自HyClone公司；二甲基亚砜、胰酶购自Sigma公司；C2C12细胞系购自中科院上海细胞库。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取和cDNA合成 采集同一头关岭牛背最长肌、小肠、肝、大腿肌、心、脂肪组织，将新鲜的组织置于液氮中，保存于-80 ℃低温冰箱中。利用Trizol法对不同组织样品的总RNA进行提取，并用微量分光光度计测定RNA的浓度和纯度。利用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。按照TransStart®One-Step gDNA Removal and cDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 反转录试剂盒操作说明进行反转录得到cDNA。RNA模板1 μL，Random Primer 1 μL，gDNA Remove 1 μL，TransScriptTMRT Mix 1 μL，2×TS Reaction Mix 10 μL，补加RNase-free水到10 μL。25 ℃孵育10 min后，42 ℃孵育30 min，85 ℃加热5 min。-20 ℃保存，进行后续的荧光定量PCR反应。

1.2.2 实时荧光定量PCR 参照NCBI中牛β-actin(AY152693)和MyoDI(NM_001040478)基因序列，结合Primier5.0和Oligo软件进行分析设计特异性qRT-RCR引物(表1)，引物由上海生工合成。

实时荧光定量PCR采用10 μL反应体系，采用Bio-rad iQ5 伯乐荧光定量PCR仪进行定量分析。每个样品不同基因的表达均以β-actin为对照，每个样品检测做3个平行试验。扩增反应结束后由熔解曲线判定PCR反应的特异性，根据标准曲线以及Ct值计算定量结果。

表1 荧光定量PCR扩增引物序列及参数

Table 1 Primer sequences and parameters used for real-time quantitative PCR

名称Name引物序列(5'-3')Primersequence退火温度/℃Annealingtemperature片段长度/bpFragmentsizeMyoDIS:GCTACTTCGCGACCAGGACA:CGCTGTAGTCCATCATGCCGT50.7158β-actinS:GCAGGTCATCACCATCGGA:GCTGTCACCTTCACCGTTC58.3564

S.上游引物；A．下游引物

S．Sense；A．Antisense

1.2.3 数据分析 SPSS18.0计算重复样品间Ct均值及标准偏差，采用2-△△Ct方法处理数据，分析MyoDI基因在不同组织中的差异表达量[25]。首先计算各组织样的目的基因与内参基因的Ct值，即△Ct= Ct(目的基因)-Ct(内参基因)，然后计算各组织样△Ct平均值，选取小肠做对照，用其他组织样减去小肠组织样的△Ct，即为比较的Ct(△△Ct)；2-△△Ct表示试验目的基因的表达相对于对照组变化的倍数[26]。

1.2.4 PCR扩增MyoDI启动子区 根据GenBank中公布的牛MyoDI(GenBank No.：281938)基因序列，用FIRSTEF程序(http：//rμlai.cshl.org/tools/FirstEF/)进行启动子预测，另外结合实验室前期的工作结果，用Primer5.0设计4对5′端加磷的引物(表2)，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。以关岭牛血液DNA为模板扩增MyoDI启动子P1～P4片段，扩增体系20 μL。PCR条件(表2)：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，退火30 s；72 ℃延伸；循环35次；72 ℃延伸2 min。反应产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.5 PCR扩增不含CMV区的pEGFP-N3载体片段 以pEGFP-N3质粒为模板进行PCR扩增。上游引物：5′-GCTAGCGCTACCGGACTCA-GAT-3′，下游引物：5′-ATTAATAACTAATGCA-TGGCGG-3′，总反应体系为20 μL。扩增条件：98 ℃预变性 3 min；98 ℃变性10 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，10个循环； 98 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，25个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。反应结束后，用1.0%琼脂糖凝电泳检测PCR产物。

表2 用于PCR扩增的引物信息

Table 2 Information of primers for PCR

名称Name引物序列(5'-3')Primersequence退火温度/℃Annealingtemperature延伸时间/sExtensiontime片段长度/bpFragmentssizeP1(-1895～+557bp)S:ACCTCCCGACATCATACATTA:GGTTTGGGTTGCTAGACG55802452P2(-976～+17bp)S:GTGGAGTTCCGCTTGTTGA:CTCCCCACCCCTACTTTC6035993P3(-420～+17bp)S:CTCCCTGATTCGGTAGATCA:CTCCCCACCCCTACTTTC5116437P4(-108～+17bp)S:CTCCCTGCTCTGTTCCTATTA:CTCCCCACCCCTACTTTC567125

S．上游引物；A．下游引物

S．Sense；A．Antisense

1.2.6MyoDI启动子与pEGFP-N3片段的连接及转化 将PCR获得的不同DNA片段分别用胶回收试剂盒回收纯化。将4段不同长度的MyoDI启动子片段分别与不含CMV区的pEGFP-N3片段平末端连接。连接产物转化至预先用CaCl2法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，均匀涂布于含50 μg·mL-1卡那霉素的LB固体培养基上，静置1 h，再倒置培养16～24 h。

1.2.7 菌落PCR鉴定和重组质粒PCR鉴定 将含卡那霉素的LB固体培养基上长出的阳性克隆菌落编号，再选取这些阳性菌落进行菌落PCR。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。

选取电泳中和阳性对照有一致条带的阳性菌落接种到含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中扩大培养，用质粒提取试剂盒提取重组质粒。用提取的重组质粒作为模板，进行重组质粒PCR。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。

1.2.8 重组质粒的酶切及测序鉴定 选取只能扩增出和阳性对照有一致条带的重组质粒，用限制性内切酶Hind III酶切验证片段连接的顺序。酶切产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。将同一阳性克隆的质粒送至上海英骏公司测序。

1.2.9 C2C12细胞的培养和重组质粒的转染 用含20%胎牛血清的DMEM培养基，37 ℃，5% CO2条件下培养C2C12细胞。待C2C12细胞贴壁后，根据培养基的颜色变化更换新的培养基。取处于对数生长期状态良好的细胞，利用脂质体转染法转染重组质粒pEGFP-N3-MyoDI和对照空质粒pEGFP-N3，每个样品重复3孔。转染具体步骤：转染前1 d将小鼠C2C12细胞接种至24孔板中，1×105个·孔-1，使细胞达到90%～95%。用50 μL Opti-MEM稀释重组质粒DNA，轻轻混合，取2 μL LipofectamineTM2000用50 μL Opti-MEM稀释，轻轻混合，室温孵育5 min；将50 μL LipofectamineTM2000混合物加入重组质粒混合物中，总体积为100 μL，轻轻混合，室温孵育20 min；将100 μL DNA-LipofectamineTM2000混合物加入24孔板中，轻轻混匀，培养6 h后更换培养基，37 ℃，5% CO2条件下培养。在转染后24 h，将培养板置于尼康荧光倒置显微镜下，在蓝色滤镜下用445～490 nm的激发光光源观察C2C12细胞有无表达的发绿色荧光的GFP物质[27]。

2 结 果

2.1 实时荧光定量PCR产物特异性分析

由图1可见，β-actin和MyoDI基因扩增曲线均呈现“S”形，说明β-actin和MyoDI基因的动力学曲线整体平行性较好，曲线拐点清晰，基线平而无明显上扬趋势。由图2可见，熔解曲线图显示梯度模板熔解曲线集中。熔解曲线上只有一个明显的峰，表明在实时荧光定量PCR过程中，荧光强度均来自于特异性的扩增产物，目的基因及内参基因没有产生非特异性扩增及引物二聚体，引物特异性好。

2.2MyoDI基因在关岭牛不同组织中的qRT-PCR分析

结果显示，MyoDImRNA在所检测的6个组织样中均有表达，且以小肠为对照，背最长肌中表达量最高，小肠中表达量最低(图3)。

图1 β-actin和MyoD I基因的扩增曲线Fig.1 The amplification curve of β-actin and MyoD I genes

图2 β-actin和MyoD I基因的熔解曲线Fig.2 The melting curve of β-actin and MyoD I genes

1.小肠；2.脂肪；3.肝；4.大腿肌；5.心；6.背最长肌1.Small intestine；2.Fat；3.Liver；4.Muscle of thigh；5.Heart；6.Longissimus dorsi图3 MyoD I mRNA 在关岭牛不同组织中的表达Fig.3 The expressing level of MyoD I gene in different tissues in Guanling cattle

2.3MyoDI基因启动子片段的扩增

以提取的血液DNA为模板，将PCR扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳，分别在2 452、993、437和125 bp处出现条带，与目的条带大小一致(图4)。

M.DNA相对分子质量标准；1、2、3、4.P1、P2、P3、P4 PCR产物M.Marker 15000；1，2，3，4.The PCR products of P1，P2，P3，P4图4 不同长度MyoD I启动子片段PCR产物Fig.4 PCR product of MyoD I promoters with different length

2.4 扩增不含CMV区的pEGFP-N3载体片段

以摇菌提质粒获得的pEGFP-N3质粒为模板进行PCR扩增获得不含启动子区的pEGFP-N3载体片段，获得的凝胶条带与目的条带一致(图5)。

M.DNA相对分子质量标准；1、2.pEGFP-N3载体目的条带M.Marker15000；1，2.The target fragments of pEGFP-N3图5 不含启动子区的pEGFP-N3载体片段PCR产物Fig.5 PCR product of pEGFP-N3 vector without promoter region

2.5 重组质粒pEGFP-N3-MyoDI的PCR鉴定

选取阳性重组质粒经PCR扩增出2 452、993、437和125 bp片段与阳性对照获得的P1、P2、P3、P4片段一致，而阴性对照则没有目的片段出现。试验结果(图6)和预期的一致。

M.DNA相对分子质量标准；1、2、3、4.P1～P4重组质粒PCR鉴定M.Marker5000；1，2，3，4.PCR identification of P1-P4 reconstructed plasmid图6 重组质粒PCR鉴定Fig.6 Identification of PCR product of reconstructed plasmid

2.6 重组质粒pEGFP-N3-MyoDI酶切和测序鉴定

目的片段和质粒片段是平末端连接，酶切可以验证目的片段插入的顺序。重组质粒pEGFP-N3-P1和pEGFP-N3-P2分别在目的片段和质粒片段上有两个Hind III酶切位点，重组质粒pEGFP-N3-P1经限制性内切酶Hind III酶切，可以获得大小约1.4 和5.3 kb的条带(图7)；重组质粒pEGFP-N3-P2经限制性内切酶Hind III酶切可以获得大小约776 bp和4.3 kb的条带。重组质粒pEGFP-N3-P3、pEGFP-N3-P4只在质粒片段有一个Hind III酶切位点，重组质粒pEGFP-N3-P3、pEGFP-N3-P4经限制性内切酶Hind III酶切可分别得到大小约4.6和4.2 kb的条带。结果证明，P1、P2片段已经以正确的顺序成功替换真核表达载体pEGFP-N3的CMV区；P3、P4片段成功替换真核表达载体pEGFP-N3的CMV区(图8)，但插入顺序还需要通过测序进一步验证。将英骏公司测序结果与NCBI中的序列进行比对，吻合度达到99%以上，表明4个不同的重组质粒pEGFP-N3-MyoDI构建成功。

M.Marker5000；1.pEGFP-N3-P1；2.pEGFP-N3-P2；3.pEGFP-N3-P3；4.pEGFP-N3-P4图7 重组质粒的双酶切鉴定Fig.7 Identification of restriction analysis of reconstructed plasmid

2.7 重组质粒pEGFP-N3-MyoDI在小鼠C2C12细胞中的表达

重组质粒pEGFP-N3-MyoDI和质粒pEGFP-N3转染小鼠C2C12细胞30 h后荧光达到最大值，用荧光倒置显微镜观察重组质粒在小鼠C2C12细胞中的表达情况。可见重组质粒pEGFP-N3-MyoDI和质粒pEGFP-N3转染小鼠C2C12细胞，细胞荧光的表达量为pEGFP-N3>pEGFP-N3-P3>pEGFP-N3-P2>pEGFP-N3-P4>pEGFP-N3-P1，且绿色荧光蛋白在部分小鼠C2C12细胞的细胞质和细胞核中均有表达，表现为强绿色荧光(图9)，推测P3可能为MyoDI基因的核心启动子区。

3 讨 论

生肌调节因子(MRFs)家族是控制骨骼肌生成的关键调节因子。生肌分化因子(MyoDⅠ)是骨骼肌生长发育过程中重要的正调控基因，在肌肉特异基因转录调控中起着决定性的作用[28]。

本试验采用qRT-PCR方法对MyoDI基因在关岭牛大腿肌、背最长肌、小肠、心、肝、脂肪6个组织中mRNA的表达量进行了测定。研究结果表明，MyoDI基因在背最长肌中表达量最高，在心中表达量其次，在小肠中表达量最低。MyoDI基因在肌肉中表达量相对较高，与李飞等[24]证实的MyoDI基因为肌肉组织特异性基因的结论相一致。本研究选取了小鼠的成肌细胞(C2C12)为研究对象，在细胞水平上验证MyoDI基因启动子的功能和活性，为后续在小鼠体内验证启动子的功能和活性提供基础。

图8 重组质粒pEGFP-N3-MyoD I(B)与pEGFP-N3载体(A)Fig.8 pEGFP-N3-MyoD I recombinant plasmid(B) and pEGFP-N3 vectors(A)

A.pEGFP-N3-P1重组载体；B.pEGFP-N3-P2重组载体；C.pEGFP-N3-P3重组载体；D.pEGFP-N3-P4重组载体；E.pEGFP-N3载体；F.未转染质粒组A.pEGFP-N3-P1 reconstruction vector；B.pEGFP-N3-P2 reconstruction vector；C.pEGFP-N3-P3 reconstruction vector；D.pEGFP-N3-P4 reconstruction vector；E.pEGFP-N3 vector；F.Plasmid untransfected图9 重组表达载体pEGFP-N3-MyoD I转染30 h后小鼠C2C12细胞绿色荧光情况 200×Fig.9 The green fluorescence of pEGFP-N3-MyoD transfected into C2C12 cell 200×

由于在扩增不含CMV区的pEGFP-N3载体片段时对克隆位置要求精确，因此本研究采用高保真DNA聚合酶进行扩增，与P1、P2、P3、P4片段进行平末端连接，通过采用加磷的引物可以增加平末端连接的机率。试验通过菌液PCR、酶切、测序的方法验证阳性克隆子，结果显示，与传统的双酶切方法相比，本方法具有不受酶切位点限制的优势，同时也避免引入新的酶切位点，克服了目的片段上有双酶切位点而导致在内切酶选择上的困难。通过此种方法可以实现在载体的任意位置连接需要的目的片段而无需考虑酶切位点。

真核生物启动子属于mRNA基因启动子，位于结构基因5′端上游，主要包括TATA-box、起始子、CAAT-box和GC-box等。TATA-box和起始子被称为核心启动子[29-30]，其中TATA-box是转录因子TFIID的TBP亚基的结合位点。本研究通过替换pEGFP-N3载体的CMV区，观察转染前后C2C12细胞的荧光强度，判定目的启动子的启动活性。结果显示，MyoDI片段的P2、P3、P4片段均可启动pEGFP-N3载体的EGFP荧光蛋白表达区，启动活性为P3>P2>P4>P1。因此，推测P3可能为MyoDI基因核心启动子区，P1和P2片段启动活性较低可能由于含有抑制启动子活性的区域，P4片段由于长度较短可能缺失具有启动活性的核心区域，影响表达量。通过构建启动子pEGFP-N3-MyoDI真核表达载体，可为后续构建转基因小鼠模型提供分子学依据，为进一步验证MyoDI基因启动子活性与功能奠定基础。

4 结 论

本研究分析了关岭牛MyoDI基因在大腿肌、背最长肌、肝、脂肪、心、小肠6个组织中的表达量，克隆了4个关岭牛MyoDI基因启动子区，精确替换pEGFP-N3的CMV区，构建了重组表达载体pEGFP-N3-MyoDI，转染小鼠C2C12细胞。结果显示，MyoDI基因在关岭牛肌肉组织中表达量较高，推测出P3片段为MyoDI基因核心启动子区。

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(编辑 郭云雁)

Construction ofMyoDIPromoter Eukaryotic Expression Vector in Guanling Cattle and Its Expression in Mouse C2C12 Cells

HUAN Cong-cong1，2，XU Hou-qiang2*，CHEN Wei1，2，CHEN Xiang2，ZHAO Jia-fu2，ZHANG Wen2，ZHOU Di2，XIA Dan2

(1.CollegeofLifeScience，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China；2.KeyLaboratoryofAnimalGenetics，BreedingandReproductioninthePlateauMountainousRegionofMinistryofEducation，CollegeofAnimalScience，GuizhouUniversity/GuizhouKeyLaboratoryofAnimalGenetics，BreedingandReproduction，Guiyang550025，China)

The aim of this study was to analyze promoter activity of 4 different lengthsMyoDIpromoters in Guanling cattle and determine preliminarily the position of the core gene promoter.The relative expression quantity was detected in different tissues of Guanling cattle by real-time quantitative PCR.The DNA extracted from Guanling cattle blood was as a template and the phosphorylated 5'end PCR primers was designed to amplify 4 different lengthsMyoDIpromoters in Guanling cattle，ultimately accurately replaced the CMV region of pEGFP-N3 vector and got eukaryotic expression vector pEGFP-N3-MyoDI.Then the recombinant plasmid was transiently transfected into mouse C2C12 cells by liposome method.The aim was to verify promoter activity ofMyoDIpromoter by Luminous intensity of mouse C2C12 cells.The expression level ofMyoDIgene was the highest in muscle，the fragment was inserted into an expression vector，the recombinant plasmid could be successfully expressed in mouse C2C12 cells with green fluorescence under the excitation light.In this study,eukaryotic expression vector pEGFP-N3-MyoDIis successfully constructed，4 promoters constructed show promoter activity，expression quantity of P3promoter is the highest，so P3promoter is regarded as the core promoter ofMyoDIgene.

MyoDI；eukaryotic expression vector；C2C12 cell；promoter；relative expression quantity

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.006

2014-07-28

转基因生物新品种培育重大专项 (2013ZX08009-004)；黔科合重大专项(字[2013]6008号)；贵州省科技厅农业攻关项目(黔科合NY字[2012]3008号)；贵州大学研究生创新基金(研农2014021)

桓聪聪(1989-)，女，河南许昌人，硕士生，主要从事细胞分子生物学研究，E-mail: huancongcong@126.com

*通信作者：许厚强，博士，教授，主要从事细胞分子生物学研究，E-mail：houqiang0524@yahoo.com

S823；S813.3

A

0366-6964(2015)05-0719-09