基于16S rRNA基因的鼠Mycoplasmahaemomuris的分子鉴定和种系发育分析

白挨泉，李高强.，郭建超.，李 欣，蒲文珺，李国清，陈志伟，张浩吉*

(1.佛山科学技术学院，佛山 528231；2.华南农业大学，广州 510642； 3.香港大学李嘉诚医学院，香港 999077)

基于16S rRNA基因的鼠Mycoplasmahaemomuris的分子鉴定和种系发育分析

白挨泉1，李高强1.2，郭建超1.2，李 欣1，蒲文珺1，李国清2，陈志伟3，张浩吉1*

(1.佛山科学技术学院，佛山 528231；2.华南农业大学，广州 510642； 3.香港大学李嘉诚医学院，香港 999077)

为了从分子水平揭示野生鼠类血原体的种类特征和系统发生关系，无菌采集32份野生白腹巨鼠血样，抽提全血基因组DNA，采用真细菌的通用引物进行16S rRNA基因的扩增，对扩增产物进行克隆和测序。结果从其中21只血样中成功地扩增出目的片段大小的核苷酸序列。对阳性产物进行克隆、测序，获得了两条代表性序列(GenBank登录号HQ183731和 HQ183732)。序列分析显示，获得的两条序列与GenBank中收录的鼠Mycoplasmahaemomuris16S rRNA 基因(AB758435)相似性最高，分别为95%和97%。两个样本间16S rRNA 基因序列相似性达98.3%。种系发育分析表明，获得白腹巨鼠血原体的两条序列形成了独立的进化分支，并与来自野鼠的Haemobartonellamuris(HMU82963) 和来自家鼠M.haemomuris(AB758435) 所形成的进化分枝为姊妹枝。上述研究证明，白腹巨鼠具有较普遍的M.haemomuris感染，并与已报道的啮齿动物M.haemomuris有一定的遗传差异，是一种新基因型的血原体。对进一步研究人和动物的亲血性支原体的流行病学、种群生物学等研究具有一定价值。

鼠；Mycoplasmahaemomuris；16S rRNA基因；分子鉴定；种系发育分析

附红细胞体(Eperythrozoon)是以往在分类上归属于立克次体目(Rickettsiales)的一类病原，可寄生于猪、牛、绵羊、山羊、犬、猫、鼠等多种动物和人的红细胞表面或游离于血浆中[1-3]，导致感染宿主的红细胞损伤，引起动物表现出贫血、黄疸、发热、生长缓慢、慢性干咳甚至突然死亡[4-5]。新近的分类学研究证明，以往归属于立克次体目的附红细胞体属和血巴尔通体属(Haemobartonella)应该划归为支原体属(Mycoplasm)，是一类亲血性支原体(hemotropicmycoplasma)，也称之为血原体(haemplasm)[6-7]。

不同动物所感染这类附红细胞体的种类不同，致病性亦有差异[8]。传统的附红细胞体种类鉴定主要是依据形态特征和所发现的宿主动物来确定，但由于这类病原的形态较小、缺乏细胞壁，是一种多形性的微生物，不同种类的附红细胞体往往在形态学上(光镜和电镜观察)缺乏明显的鉴别特征[9]。分子鉴定能避免传统分类中以所发现动物来定种的简单性，从基因水平反映附红细胞体的种类特征。因此，借助现代分子生物学技术，开展附红细胞体的分子鉴定，对研究不同种类附红细胞体的宿主范围、传染方式、流行特征、发病和危害具有重要的意义。16S rRNA 基因是进行血原体种属鉴定和分类研究的首选遗传标记[10-11]。本研究采集野生白腹巨鼠血样，在血涂片染色、光镜观察的基础上，开展鼠血原体16S rRNA 基因序列测定和种系发育分析，旨在从分子水平揭示鼠血原体的种类特征和系统发生关系，为这类人兽共患病的流行与防治研究提供资料。

1 材料与方法

1.1 试剂

基因组小量抽提试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；多功能DNA纯化回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；Premix ExTaq、DL2000 DNA Marker、pMD 18-T载体购自宝生物(大连)工程有限公司；E.coliDH5α为本实验室保存；其他相关试剂均为国产分析纯。

1.2 样品来源及全血基因组DNA的抽提

无菌采集来自湖南和广西的野生白腹巨鼠血样2 mL，经40 g·L-1EDTA-Na2抗凝处理后，取抗凝血涂片，进行常规吉姆萨染色，镜检。随后按照基因组小量抽提试剂盒说明书抽提全血基因组DNA，置-20 ℃冰箱保存，作为PCR反应的模板。

1.3 引物和16S rRNA基因的PCR扩增

试验用文献[12]报道的通用引物对fHf1/rHf2，该引物对能扩增出真细菌几乎全长的16S rRNA基因，引物序列为fHf1：5′-ACGCGTCGACAGAG-TTTGATCCTGGCT-3′；rHf2：5′-CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT-3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

PCR反应体系为50 μL，其中2×PCR Premix ExTaq25 μL (组成：TaKaRa ExTaq1.25 U，2×dNTPs各0.4 mmol·L-1，2× ExTaqBuffer，4 mmol·L-1Mg2+)，引物对fHf1/rHf2各1 μL(25 mmol·L-1)，DNA模板1 μL，dd H2O 22 μL。扩增程序：95 ℃ 预变性5 min，随后95 ℃ 45 s，50 ℃ 2 min，72 ℃ 1 min，进行32个循环；最后在72 ℃延伸 5 min。以本实验室构建的鼠梨形虫18S rRNA基因的重组质粒作为阳性对照，以蒸馏水为阴性对照。

1.4 PCR产物的克隆和序列测定

取5.0 μL PCR产物，用10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳(90 V，15 min)，然后在紫外透视仪上观察扩增片段大小。PCR产物的纯化及与pMD 18-T载体的连接分别参照试剂盒说明书进行。连接产物的转化和阳性克隆的筛选按照常规的分子克隆方法进行。将筛选的阳性克隆接种于含100 mL·L-1Amp+的LB液体培养基中培养18 h，取3 mL经菌液PCR鉴定为阳性的重组菌液送上海Invitrogen公司进行核苷酸序列测定。

1.5 序列的同源性比对和种系发育分析

对测序获得阳性序列进行拼接、比较和分析。利用Clustal X 1.81[13]对获得的线粒体序列分别进行比对分析，眼观修正比对结果，利用和DNAStar 6.0对不同种类亲血型支原体的16S rRNA基因序列进行相似性计算。利用三种方法来构建种系发育关系树，分别为贝叶斯法(Bayes)、最大似然法(ML)和邻接法(NJ)[14-16]。构建系统树的可靠性采用自展值检验来评估，复制数为1 000。为揭示白腹巨鼠的血原体与其他种类血原体之间的种系进化关系，本研究还与其他相关亲血型支原体序列进行了比较(见表1)，以肺炎支原体(M.pneumoniae)(M29061)为外群，用Tree View Program version 1.65[17]绘制种系发育关系树。

表1 用于系统进化分析的亲血性支原体种类信息表

Table 1 HemotropicMycoplasmasamples used in the present study

病原名称Species/Samplecode宿主Host地理分布GeographicaloriginGenBank登录号GenBankNo．M．haemomuris⁃MH1白腹巨鼠Rattusedwardsi中国ChinaHQ183731M．haemomuris⁃MH2白腹巨鼠Rattusedwardsi中国ChinaHQ183732Haemobartonellamuris野鼠Wildmice日本JapanHMU82963M．haemomuris黑鼠Rattusrattus日本JapanAB758435M．coccoides鼠Mouse英国UKAY171918M．sp．褐家鼠Rattusnorvegicus日本JapanAB752303CandidatusM．turicensis猫Cat南非SouthAfricaDQ464422M．haemofelis猫Cat英国UKAY150985M．erythrodidelphis黑耳负鼠Didelphismarsupialis美洲AmericaAF178676M．ovis绵羊Sheep美洲AmericaAF338268M．wenyonii牛Cattle日本JapanEU367963M．suis猪Pig中国ChinaAY492086M．haemolama羊驼Alpaca美洲AmericaAF306346CandidatusM．kahanei松鼠猴Saimirisciureus-AF338269M．haemocanis犬Dog德国GermanyAY150973CandidatusM．haemoparvum犬Dog法国FrenchAY532390M．pneumoniae--M29061

2 结 果

2.1 白腹巨鼠血样的光镜观察

将无菌采集的32份白腹巨鼠血液样品，用鲜血压滴标本检查和血液涂片吉姆萨染色后镜检，其中2/3的血液样品均看到文献[18]中有关附红细胞体光镜观察的特征。

2.2 PCR扩增

利用能扩增出真细菌几乎全长的16S rRNA基因的引物对fHf1/rHf2，对来自广西和湖南的32份血液样品中进行检测，发现有21份血液样品扩增得到大小约为1 400 bp的条带，与预期片段大小相符，在猪附红细胞体GD株为阳性对照的PCR产物中，也出现了大小相近的条带，以蒸馏水为阴性对照无特异性条带出现。部分样品的PCR扩增结果见图1。总共32份白腹巨鼠的血液样品进行PCR扩增结果显示，21份样品扩增结果为阳性，总体阳性率为65.63%(21/32)。

2.3 序列测定

对其中2份代表性样品MH1和MH2的PCR产物进行克隆测序，分别获得为1 342 (MH1) 和1 360 bp(MH2)的16S rRNA基因片段，其A+T含量分别为54.55%和54.63%。获得序列的Blast结果显示，源自白腹巨鼠的两个样品MH1和MH2间16S rRNA 基因的相似性为98.3%，与GenBank中收录的鼠Mycoplasmahaemomuris16S rRNA基因(序列号AB758435)相似性最高，分别为95%和97%。代表性样品MH1和MH2的序列已提交到GenBank，登录号分别为HQ183732和HQ183732。

2.4 种系发育分析结果

以肺炎支原体为外群，基于16S rRNA 基因序列用BI、ML和NJ三种方法重构白腹巨鼠支原体及其他种类支原体的系统发育关系。结果显示，除了bootstrap值外，三种方法所构建的种系发育树的拓扑结构基本一致(图2)。源自野鼠血原体的两条序列MH1和MH2形成了独立的进化分支，该进化分枝与来自野鼠的H.muris(HMU82963) 和来自家鼠M.haemomuris(AB758435) 所形成的进化枝互为姊妹枝，处于同一大的进化枝上。白腹巨鼠血原体与已报道日本褐家鼠的M.sp.(AB752303)和英国鼠的M.coccoides(AY171918)表现出较大的遗传差异。系统进化分析进一步证明了来自我国白腹巨鼠的血原体为M.haemomuris，并且与以往报道的啮齿动物血原体种类存在明显差异，暂定为一种新基因型的M.haemomuris，命名为M.haemomuris白腹巨鼠株(简称为MH1、MH2株)。

M.DL2000DNA相对分子质量标准；1 .阴性对照；2～9 .白腹巨鼠血样；10 .阳性对照M.DL2000DNA marker；1.Negative control；2-9 .Samples from Rattus edwardsi；10 .Positive control图1 代表性样品PCR扩增结果Fig.1 Results of PCR amplification in representative samples

节点处数据由左到右依次为Bayes、ML、NJ的Bootstrap值(%);“ns.”表示无支持率Numbers at nodes indicate bootstrap values resultiong from Bayes/ML/NJ，and no values support are given as “ns.”图2 基于16S rRNA 基因的亲血性支原体系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of hemotropic Mycoplasma spp.based on 16S rRNA gene sequences

3 讨 论

国内对鼠的附红细胞体研究较少，作者应用分子生物学方法，确定了我国野生鼠类——白腹巨鼠有M.haemomuris感染，且感染率较高，达到65.63%(21/32)。基于16S rRNA基因序列分析表明，在白腹巨鼠体内发现的这种血原体与国外报道的鼠源种类存在明显的差异，推测是一种新基因型的M.haemomuris。这种源自白腹巨鼠的新基因型的M.haemomuris，是否可感染其他啮齿动物、致病性和危害等方面，有待进一步研究。

附红细胞体属和血巴尔通体属是寄生于红细胞表面或游离于血浆的病原体，传统的属间鉴定标准主要基于两方面：⑴ 在显微镜下观察，附红细胞体通常呈环形，而血巴尔通体很少见到这种形态；⑵ 附红细胞体既可附着在红细胞表面，也可游离于血浆中，而血巴尔通体主要附着于红细胞表面，在血浆里少见或没有。在1984 年出版的《伯氏细菌鉴定手册》中记载的感染鼠类的这类病原有鼠血巴尔通体(H.muris)和球形附红细胞体(E.coccoides)。近来的分类学研究认为，这两种病原均为支原体属(Mycoplasma)，并分别命名为M.haemomuris和M.coccoides[19-20]。本研究基于16S rRNA基因序列分析进一步表明，曾经归属于立克次体目、无形体科的H.muris(HMU82963)与M.haemomuris(AB758435)的16S rRNA基因序列相似性达99%以上，在遗传关系上处于相同的进化分枝，为同种病原。本研究报道的白腹巨鼠血原体与M.haemomuris(AB758435)的进化关系最近，而与已报道的英国鼠的M.coccoides(AY171918)和日本褐家鼠的M.sp.(AB752303)的遗传差异较大。

H.Sashida等(2013)通过对采集自日本的小田鼠和黑鼠的M.haemomuris的16S rRNA基因序列相似性达99%以上，但根据样品ITS的系统进化分析将M.haemomuris可分为A、B两个群，其中A群样品来自小田鼠，而B群来自黑鼠，A、B群之间的ITS序列相似性为84.9%，因此认为M.haemomuris的ITS序列具有稳定的遗传特征并能反映M.haemomuris的宿主趋向性[21]。作者获得的白腹巨鼠的两个样本MH1和MH2间16S rRNA 基因的相似性为98.3%，存在一定的遗传差异，这种差异表现在ITS序列上的遗传特征及其生物学意义有必要深入研究。

[1] MESSICK J B.Hemotrophicmycoplasmas(hemoplasmas)：a review and new insights into pathogenic potential[J].VetClinPathol，2004，33(1)：2-13.

[2] HOELZLE L E.Haemotrophicmycoplasmas：recent advances inMycoplasmasuis[J].VetMicrobiol，2008，130 (3-4)：215-226.

[3] DOS SANTOS A P，DOS SANTOS R P ，BIONDO A W，et al.Hemoplasma infection in HIV-positive patient，Brazil[J].EmergInfectDis，2008，14(12):1922-1924.

[4] RIKIHISA Y，KAWAHARA M，WEN B，et al.Western immunoblot analysis ofHaemobartonellamurisand comparison of 16S rRNA gene sequences ofH.muris，H.felis，andEperythrozoonsuis[J].JClinMicrobiol，1997，35(4)：823-829.

[5] ZHUANG Q J，ZHANG H J，LIN R Q，et al.The occurrence of the feline "CandidatusMycoplasmahaemominutum" in dog in China confirmed by sequence-based analysis of ribosomal DNA[J].TropAnimHealthProd，2009，41(4)：689-692.

[6] NEIMARK H，JOHANSSON K E，RIKIHISA Y，et al.Proposal to transfer some members of the generaHaemobartonellaandEperythrozoonto the genusMycoplasmawith descriptions of ‘CandidatusMycoplasmahaemofelis’，‘CandidatusMycoplasmahaemomuris’，‘CandidatusMycoplasmahaemosuis’ and ‘CandidatusMycoplasmawenyonii’[J].IntJSystEvolMicrobiol，2001，51(Pt 3):891-899.

[7] WILLI B，BORETTI F S，TASKER S，et al.FromHaemobartonellatohemoplasma：molecular methods provide new insights[J].VetMicrobiol，2007，125 (3-4)：197-209.

[8] WILLI B，BORETTI F S，CATTORI V，et al.Identification，molecular characterization，and experimental transmission of a newhemoplasmaisolate from a cat with hemolytic anemia in Switzerland[J].JClinMicrobiol，2005，43(6)：2581-2585.

[9] MESSICK J B，BERENT L M，EHRHART E J，et al.Light and electron microscopic features of eperythrozoon-like parasites in a North American opossum (Didelphis virginiana)[J].JZooWildlMed，2000，31(2)：240-243.

[10] 李月梅，邢 莹，张守发，等.东北三省部分地区猪附红细胞体16S rRNA核苷酸序列比较分析[J].中国农业大学学报，2010，15(2)：59-63. LI Y M，XING Y，ZHANG S F，et al.Comparative analysis of nucleotide sequence 16S rRNA of Eperythrozoon suis of three provinces in northeast[J].JournalofChinaAgriculturalUniversity，2010，15(2)：59-63.(in Chinese)

[11] SYKES J E，TERRY J C，LINDSAY L L，et al.Prevalences of varioushemoplasmaspecies among cats in the United States with possible hemoplasmosis[J].JAmVetMedAssoc，2008，232(3)：372-379.

[12] 张浩吉，谢明权，张健騑，等.猪附红细胞体16S rRNA基因的序列测定和系统进化分析[J].畜牧兽医学报，2005，36(6):596-601. ZHANG H J，XIE M Q，ZHANG J F，et al.Sequencing and phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene ofEperythrozoonsuis[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2005，36(6):596-601.(in Chinese)[13] THOMPSON J D，GIBSON T J，PLEWNIAK F，et al.The CLUSTAL_X windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].NucleicAcidsRes，1997，25 (24)：4876-4882.

[14] SWOFFORD D L.PAUP*：Phylogenetic analysis using parsimony (and other methods)[CP].Sinauer Associates，Sunderland，MA，2002.

[15] GUINDON S，GASCUEL O.A simple，fast，and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood[J].SystBiol，2003，52(5):696-704.

[16] RONQUIST F，HUELSENBECK J P.MrBayes 3：Bayesian phylogenetic inference under mixed models[J].Bioinformatics，2003，19 (12)：1572-1574.

[17] PAGE R D.TreeView：an application to display phylogenetic trees on personal computers[J].ComputApplBiosci，1996，12(4)：357-358.

[18] 张浩吉，谢明权，张健騑，等.猪附红细胞体PCR检测方法的建立和初步应用[J].中国兽医学报，2005，25(5):480-483. ZHANG H J，XIE M Q，ZHANG J F，et al.Development and preliminary application of PCR assay based on the 16S rRNA gene for detection ofEperythrozoonsuisinfection[J].ChineseJunrnalofVeterinaryScience，2005，25(5)：480-483.(in Chinese)

[19] NEIMARK H，PETERS W，ROBINSON B L，et al.Phylogenetic analysis and description ofEperythrozooncoccoides，proposal to transfer to the genusMycoplasmaasMycoplasmacoccoidescomb.nov.and request for an opinion[J].IntJSystEvolMicrobiol，2005，55(Pt 3):1385-1391.

[20] HARASAWA R，KAWAHARA M，RIKIHISA Y.Characteristics of the 16S-23S rRNA intergenic spacer region ofMycoplasmahaemomuris，previously classified as ‘Haemobartonellamuris’[J].JVetMedSci，2002，64(12):1161-1164.

[21] SASHIDA H，SASAOKA F，SUZUKI J，et al.Two clusters amongMycoplasmahaemomurisstrains，defined by the 16S-23S rRNA intergenic transcribed spacer sequences[J].JVetMedSci，2013，75(5)：643-648.

(编辑 白永平)

Molecular Identification and Phylogenetic Analysis ofMycoplasmahaemomurisIsolates from WildRattusedwardsibased on 16S Ribosomal RNA Gene

BAI Ai-quan1，LI Gao-qiang1，2，GUO Jian-chao1，2，LI Xin1， PU Wen-jun1，LI Guo-qing2，CHEN Zhi-wei3，ZHANG Hao-ji1*

(1.SchoolofLifeSciences，FoshanUniversity，Foshan528231，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China；3.AIDSInstitute，LiKaShingFacultyofMedicine，TheUniversityofHongKong，HongKongSAR999077，China)

This experiment was conducted to study the species characteristic and phylogenetic relationship of hemoplasmas from the wild rats on molecular level.Thirty-two blood samples collected from wildRattusedwardsiin Hunan and Guangxi province of China were investigated by PCR aplication based on the 16S rRNA gene sequence.The total infection rate of hemoplasmas was 65.63% (21/32).Genetic variations showed that the inter-specific differences betweenM.haemomurisisolates and otherMycoplasmaspecies (3.0%-4.5%) were bigger than that (0.8%) between two synonymic species (HaemobartonellamurisandM.haemomuris).Phylogenetic analyses indicated thatM.haemomurisderived from wildRattusedwardsigrouped into a solitary clade closely related toH.murisandM.haemomuris. The results suggested thatM.haemomurisisolated in the present study should represent a new genotype，and temporarily namedM.haemomurisRattusedwardsistrain.These data may have important implications for researching epidemiology and population biology as well as for studying the taxonomy and status of the genusMycoplasma.

Rattusedwardsi；Mycoplasmahaemomuris；16S rRNA gene；molecular identification；phylogenetic analysis

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.025

2015-04-08

广东省自然科学基金项目(S2013010012475)；广东省教育厅科技创新项目 (2013KJCX0187)

白挨泉(1970-)，男，山西兴县人，副教授，硕士，主要从事动物传染病的教学和科研工作

*通信作者：张浩吉，E-mail：zhanghaoji@aliyun.com

S852.62

A

0366-6964(2015)08-1471-06