维拉帕米对肉鸡肺动脉高压发生过程中肺动脉平滑肌细胞c-Fos表达的影响

王建琳，乔 健

(1.青岛农业大学动物科技学院，青岛 266109；2.中国农业大学动物医学院，北京 100193)

维拉帕米对肉鸡肺动脉高压发生过程中肺动脉平滑肌细胞c-Fos表达的影响

王建琳1，乔 健2*

(1.青岛农业大学动物科技学院，青岛 266109；2.中国农业大学动物医学院，北京 100193)

研究低温诱发肉鸡肺动脉高压过程中肺动脉平滑肌细胞c-Fos的表达情况，及钙拮抗剂维拉帕米对c-Fos表达和肺动脉压的影响，从而探讨肉鸡肺动脉高压的发生机制。180只AA肉鸡14日龄随机分为对照组、低温处理组和维拉帕米组，14～49日龄，每组每周随机取6只测定肺动脉压，取肺组织固定做石蜡组织切片进行c-Fos免疫组织化学染色分析。结果显示，低温处理1周后肉鸡肺动脉压明显升高(P<0.05)，20～50 μm肺动脉平滑肌细胞c-Fos表达在处理后1周开始明显升高，50～100 μm肺动脉c-Fos表达在处理后2周开始明显升高(P<0.05)，而维拉帕米组肉鸡肺动脉压和c-Fos的表达在相应的时间内较低温组明显降低(P<0.05)。结果表明肺动脉平滑肌细胞c-Fos在低温诱发的肉鸡肺动脉压升高的过程中表达增强，阻断钙通道可抑制肉鸡肺动脉平滑肌细胞c-Fos的过高表达和肺动脉压升高。

肉鸡；肺动脉压；平滑肌细胞；c-Fos；维拉帕米

肉鸡肺动脉高压综合征(pulmonary hypertension syndrome，PHS)是由多种原因引起的，危害快速生长的肉仔鸡的一种营养代谢性疾病，以肺动脉压升高、右心肥大和腹水的形成等为主要临床特征[1]，肺血管重塑为主要组织学变化特征[2]。

本实验室前期研究发现低温诱发肉鸡肺动脉平滑肌细胞增殖是肺血管重塑的直接原因[3]，肺动脉平滑肌细胞的增殖是通过细胞周期发生改变来完成的，而细胞周期的改变与原癌基因的激活和表达增强以及钙信号的参与密切相关。已研究表明低温诱发肉鸡肺血管重塑过程中肺动脉平滑肌细胞c-Myc蛋白和c-junmRNA的表达明显增加[4-5]。利用钙通道拮抗剂-维拉帕米可明显抑制低温诱发的肉鸡肺动脉平滑肌细胞的增殖[6]、肺血管重塑和高压综合征的发生[7]。

研究报道，c-Fos的表达是肺动脉平滑肌细胞增殖的重要因素[8]，且研究发现间尼索地平能有效抑制肺动脉血管平滑肌细胞增殖和c-fos及c-junmRNA的表达，认为这与钙离子通道的抑制及抗氧化密切相关[9]。鉴于此，本研究拟对环境低温诱发肉鸡肺动脉高压发生过程中肺动脉平滑肌细胞c-Fos的表达变化，及应用维拉帕米阻断钙通道后c-Fos的表达变化及肺动脉压的变化进行研究，为肉鸡肺动脉高压的发生机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物分组

180只1日龄AA商品代肉仔鸡(购于北京华都肉鸡场)进行常规的饲养与免疫，14日龄随机分为3组，每组60只，饲养于空调动物房内。对照组，(21±1)℃环境饲养；低温处理组，(10±1)℃环境饲养；维拉帕米组，(10±1)℃环境饲养，同时饮用水中添加0.01%维拉帕米。

1.2 肺动脉压测定

14～49日龄，每组每周随机取6只肉鸡，应用生理多导仪(美国BIO PAC M P150多导生理信号记录分析系统)采用右心导管法直接测定肺动脉舒张压、肺动脉收缩压，并计算平均肺动脉压[10]。

1.3 肺动脉平滑肌细胞c-Fos 表达的研究

肉鸡测定肺动脉压后，翅静脉注射戊巴比妥钠处死，取右侧肺叶下1/3 固定、石蜡包埋、组织切片、免疫组织化学染色。采用SP试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)进行免疫组织化学常规操作，c-Fos单克隆抗体稀释度为1∶250，DAB 显色。显微镜下观察，拍照并结合图像处理系统进行分析，选择直径为20～50 μm和50～100 μm肺动脉计算c-Fos的阳性指数(PI)，PI(c-Fos)=c-Fos平滑肌细胞阳性数/平滑肌细胞总数[5]，其中将c-Fos强染的血管平滑肌细胞(棕色核)作为阳性细胞，相比之下，染色较弱的(淡黄色核)和不着色的(蓝色核)作为阴性细胞。

2 结 果

2.1 各组肉鸡肺动脉压变化

肺动脉收缩压(PASP)在21、42日龄时低温组显著高于对照组(P<0.05)，35、49日龄时极显著高于对照组(P<0.01)；21、49日龄时维拉帕米组显著低于低温组(P<0.05)，35日龄时极显著低于低温组(P<0.01)。肺动脉舒张压(PADP)在21、35和42日龄时低温组显著高于对照组(P<0.05)；21、28、35、42日龄时维拉帕米组显著低于低温组(P<0.05)。平均肺动脉压(mPAP)在21、35日龄时低温组极显著高于对照组(P<0.01)，28、42、49日龄时显著高于正常组(P<0.05)；21、28、49日龄时维拉帕米组显著低于低温组(P<0.05)，35、42日龄时极显著低于低温组(P<0.01)(表1)。

2.2 各组肉鸡肺小动脉血管平滑肌细胞c-Fos的表达

显微镜下观察发现，低温组肉鸡肺动脉平滑肌细胞c-Fos阳性细胞较多，而对照组和维拉帕米组较少(图1～3)。低温组肉鸡20～50μm肺小动脉血管平滑肌细胞PI在 21日龄时显著高于对照组(P<0.05)，从28日龄开始到49日龄极显著高于对照组(P<0.01)；维拉帕米组肉鸡20～50μm肺小动脉血管平滑肌细胞PI28～49日龄极显著低于低温组(P<0.01)，21日龄时显著低于低温组(P<0.05)(表2)。低温组肉鸡50～100μm肺小动脉血管平滑肌细胞PI28～49日龄时极显著高于对照组(P<0.05)；维拉帕米组肉鸡50～100μm肺小动脉血管平滑肌细胞PI28～49日龄极显著低于低温组(P<0.01)(表3)。

图1 对照组肉鸡肺动脉平滑肌细胞c-Fos阳性细胞较少 (200×) IHCFig.1 Pulmonary artery of broiler in the control group with a little of c-Fos positive cells (200×)

图2 低温组肉鸡肺动脉平滑肌细胞c-Fos阳性细胞较多(200×) IHC Fig.2 Pulmonary artery of broiler in the low temperature group with lots of c-Fos positive cells (200×)

图3 维拉帕米组肉鸡肺动脉平滑肌细胞c-Fos阳性细胞较少(200×) IHCFig.3 Pulmonary artery of broiler in the verapamil group with a little of c-Fos positive cells (200×)

3 讨 论

肉鸡PHS的发生原因较复杂，涉及遗传、营养、环境、管理等多方面，其中环境和营养因素是肉鸡PHS的诱发因素，以环境低温诱发肉鸡PHS已成为研究该病发生机制的主要模型[2-3，11-12]。本研究通过环境低温诱发PHS，用右心导管法直接测定肺动脉压来评价模型的建立，环境低温处理1周后，肺动脉收缩压和舒张压都明显升高，处理3周后再次明显升高，这可能与低温诱发的肺血管重塑促进肺动脉压升高有关[13]。低温处理后1周平均肺动脉压较对照组显著升高，表明环境低温成功诱发肉鸡肺动脉压升高。

肺血管重塑以肺动脉平滑肌细胞增殖形成的中膜增厚为主要特征，中膜的增厚导致肺动脉管腔缩小，根据Poiseuille定律，肺血管阻力与动脉管腔半径的四次方成反比，所以肉鸡肺血管重塑可明显促进肺动脉压升高[13-14]。根据以上研究，认为肺动脉平滑肌细胞增殖是肺动脉压升高的重要因素，而肺动脉平滑肌细胞的增殖受到多种因素调控，其中原癌基因的表达是重要因素之一。原癌基因c-Fos、c-jun和c-Myc等属于与生长和分化相关的立即早期基因，对细胞的增殖和分化等具有重要的调控作用，前期研究表明低温诱发的肉鸡肺动脉高压综合征过程中肺动脉平滑肌细胞c-junmRNA和c-Myc 表达明显升高[4-5]，表明原癌基因参与肉鸡肺动脉高压形成过程中的肺血管重塑。有研究表明内皮素-1诱导的鼠肺动脉平滑肌细胞增殖过程中c-Fos的表达是必不可少的[8]，故本试验研究环境低温诱发肉鸡肺动脉高压综合征过程中肺动脉平滑肌细胞c-Fos的表达，结果发现20～50 μm和50～100 μm肺动脉平滑肌细胞分别从低温处理后第二周和第三周显著高于对照组，表明低温明显诱发了肉鸡肺动脉平滑肌细胞c-Fos的表达。结合前期对肺动脉平滑肌细胞增殖的研究[3]，20～50 μm肺小动脉平滑肌细胞c-Fos 的表达较对照组显著增加的时间和细胞显著增殖的时间相吻合，表明c-Fos的表达与肺动脉平滑肌细胞的增殖密切相关。

当平滑肌细胞在血流剪切力、血管收缩物质和缺氧等因素的作用下，细胞外的钙离子进入细胞或胞内钙离子释放，提高了细胞质中钙离子的浓度，成为引起细胞反应的信号，这种钙信号是细胞有丝分裂和增殖所必须的[14]。细胞的胞质内钙离子浓度的升高可导致原癌基因c-Fos的表达，从而促进细胞的增殖[9]。维拉帕米作为一种钙通道阻滞剂，通过抑制钙离子内流可降低细胞胞质内钙离子的水平，本研究利用其这一作用阻断钙信号，研究肺动脉平滑肌细胞c-Fos的表达。研究结果发现维拉帕米明显抑制了低温诱发的肉鸡肺动脉平滑肌细胞c-Fos的表达，此结果与董世山等[15]应用钙通道拮抗剂对体外培养的肉鸡肺动脉血管平滑肌细胞在缺氧刺激后其内c-fosmRNA和c-Fos蛋白表达变化的影响相一致。结合前期维拉帕米对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响[6]，表明钙信号参与了低温诱发的肉鸡肺动脉平滑肌细胞c-Fos的表达，抑制了肺动脉平滑肌细胞的增殖，抑制了肺血管重塑。

钙信号不仅可以参与肺动脉平滑肌细胞有丝分裂和细胞增殖导致血管重塑，而且可以激发肺血管收缩，应用钙离子敏感性受体通道抑制剂阻断钙信号后，可明显抑制肺动脉血管的收缩和重塑，从而抑制肺动脉压升高[16]。本研究结果发现维拉帕米明显抑制低温诱发的肉鸡肺动脉压升高，这与其明显降低低温诱发的肉鸡肺动脉平滑肌细胞c-Fos的表达、抑制肺动脉平滑肌细胞增殖和肺血管重塑密切相关，也与其抑制肺动脉平滑肌收缩相关。也从反面说明了肺动脉平滑肌细胞c-Fos的表达与肺动脉平滑肌细胞增殖及肺血管重塑密切相关。

4 结 论

维拉帕米明显抑制低温诱发的肉鸡肺动脉平滑肌细胞c-Fos的表达和肺动脉高压，表明钙信号参与低温诱发的肉鸡肺动脉平滑肌细胞c-Fos的表达和肺动脉高压的形成。

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(编辑 白永平)

The Effect of Verapamil on the c-Fos Expression of Pulmonary Artery Smooth Muscular Cells in the Development of Pulmonary Hypertension in Broilers Induced by Low Ambient Temperature

WANG Jian-lin1，QIAO Jian2*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao266109，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China)

The c-Fos expression of the pulmonary arterial smooth muscle cells in the development of the pulmonary hypertension in broilers induced by low ambient temperature and the effect of verapamil on c-Fos expression were dynamically studied.One hundred and eighty 14-day-old AA broilers were randomised into three groups，control group (21 ℃±1 ℃)，low temperature group (10 ℃±1 ℃) and verapamil group (10 ℃±1 ℃，add 0.01% verapamil in drinking water).Then their pulmonary arterial pressures were measured；and the lungs of broilers were fixed to study the expression of c-Fos.The results showed that the pulmonary arterial pressure in low temperature group significantly higher than those in control group and verapamil group after exposure to low temperature one week (P<0.05)，the expression of c-Fos in 20-50 μm and 50-100 μm pulmonary arteries in low temperature group were significantly higher than those in control group and verapamil group after exposure to low temperature one and two weeks respectively (P<0.05).The results suggested that the expression of c-Fos in pulmonary arteries were significantly increased and verapamil can prevent the high expression of c-Fos and the increase of pulmonary arterial pressure.

broilers；pulmonary arterial pressure；smooth muscle cells；c-Fos；verapamil

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.020

2014-10-30

山东省自然科学基金(ZR2013CL022)；国家自然科学基金(30371063)

王建琳(1976-)，女，山西沁源人，副教授，博士，主要从事禽病发生机制的研究，E-mail：bjsxxw@126.com

*通信作者：乔 健，教授，博士生导师，E-mail：qiaojian@cau.edu.cn

S852.33

A

0366-6964(2015)08-1432-06