肌细胞增强因子2A基因P279L变异对eNOS的影响*

张 涛 慕玉东曹永胜

西安市中心医院心内科(西安710003)

肌细胞增强因子2A基因P279L变异对eNOS的影响*

张 涛 慕玉东△曹永胜

西安市中心医院心内科(西安710003)

目的：探讨肌细胞增强因子2A基因P279L变异对内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的影响。方法：选自西北地区385名汉族人，采用酚氯法提取全基因组DNA，酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清中eNOS。结果：在MEF2A-P279L的PP、PL、LL的3种基因型中，eNOS水平差异有统计学意，LL型eNOS水平明显低于LP型和PP型，PL型100.35±12.61pg/ml与PP型103.28±13.35 pg/ml差异无统计学意义(P>0.05)，但eNOS水平成上升趋势。结论：MEF2A-P279L变异影响eNOS水平，L等位基因可能具有致动脉粥样硬化的作用。

血管内皮的损伤及功能障碍是动脉粥样硬化发生发展的始动环节。一氧化氮(NO)是内皮细胞分泌的,具有抑制平滑肌细胞的增生、抑制血小板的聚集、调节血管张力等作用[1]。合成NO的关键酶是一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOS)，分三种亚型：内皮型一氧化氮合酶(Endothelial NOS,eNOS)、神经型一氧化氮合酶和免疫型一氧化氮合酶。其中eNOS分布于血管内皮细胞，参与血管功能调节[2]。肌细胞增强因子2(Myocyte enhancer factor 2A，MEF2A)编码的蛋白在细胞信号转导、激活遗传程序、控制细胞的分化、增殖、细胞形态学、生存和凋亡等方面发挥重要作用[3]。MEF2A基因突变后破坏了血管内皮的完整性，促进脂质物质在血管内皮的沉积和炎性因子的聚集，启动了动脉粥样硬化。目前国内对MEF2A-P279L基因突变与eNOS水平的影响研究较少，为了明确MEF2A-P279L基因多态性对eNOS水平的影响，本研究采用ELISA方法检测MEF2A基因在内皮细胞与动脉粥样硬化发病相关的细胞功能，进一步探索冠心病发病的机制，为冠心病的治疗提供新的靶点。

对象和方法

1 研究对象 收集2011年1月至2012年12月我院心内科住院患者，共385例，经冠状动脉造影分为冠心病组239例，男性152例，女性87例，年龄55.6±10.3岁；对照组146例，男性83例，女性63例，年龄52.6±11.2岁；均为汉族人。

2 方 法

2.1 收集样本:入院次日采取空腹20ml静脉血，离心后将血细胞及上清液分装试管，低温冰箱保存。

2.2 DNA的提取:采用酚氯法提取DNA，即采用苯酚与氯仿提取，然后应用异丙醇沉淀的方法提取。

2.3 PCR扩增:引物由陕西博森生物公司合成，引物：上游5’ CACTTTATTGAATGATATTTTTCCCC 3’，下游5’ AGGCATCATGCCCTTGCTTTA 3；PCR反应条件：94℃预变性4min，94℃变性1min，62℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环，最后72℃延伸7min。

2.4 ELISA试剂盒检测eNOS:采用双抗体的ELISA方法，按照试剂盒说明进行操作。

3 统计学方法 实验数据应用SPSS 13.0软件进行统计分析。两组间计量资料的比较采用t检验。

结 果

MEF2A-P279L不同基因型组的eNOS水平进行比较:LL型eNOS水平明显低于LP型和PP型，有显著性统计学差异,结果见表1～3。

表1 LL基因与LP基因eNOS水平的关系

SNP基因型eNOStP值MEF2A-P279LLL83.27±14.52-11.388<0.001LP100.35±12.61

表2 LL基因与PP基因eNOS水平的关系

SNP基因型eNOStP值MEF2A-P279LLL83.27±14.52-4.070<0.001PP103.28±13.35

表3 LP基因与PP基因eNOS水平的关系

SNP基因型eNOStP值MEF2A-P279LLP100.35±12.61-0.6720.502PP103.28±13.35

讨 论

冠心病是由于冠状动脉血管内皮发生粥样硬化导致心肌缺血、缺氧而引起的心血管疾病，血管内皮的损伤及功能障碍是动脉粥样硬化发生发展的始动环节[4]。内皮细胞通过NO调节血管的张力及血管重塑。NO是在一氧化氮合成酶催化下由L-精氨酸和氧分子生成的。eNOS生理作用：①下调黏附蛋白的基因表达，如抑制血管细胞黏附因子1、细胞表面黏附分子P选择素和细胞间黏附分子1的表达；②阻止单核细胞趋化蛋白1的表达，防止白细胞黏附，阻止其向内皮下迁移；③通过对脂类自由基的作用，阻止低密度脂蛋白的氧化，抑制血小板黏附聚集，阻止其向内皮下层迁移和聚集[5，6]。所以，NO是抗动脉粥样硬化及血栓形成，是防治动脉粥样硬化的关键[7,8]。

本研究结果显示：MEF2A-P279L不同基因型的eNOS血浆水平存在显著性差异，LL基因型的eNOS血浆水平显著低于LP和PP基因型，L等位基因可能具有致动脉粥样硬化的作用。我们的研究提示MEF2A-P279L基因突变后降低了eNOS血浆水平，使NO表达下降，促进内皮细胞的粥样硬化，因此我们推测MEF2A-P279L基因突变影响eNOS水平，通过调节NO的分泌调节内皮细胞的增殖、调节血小板的聚集、单核内皮细胞的粘附、血管内皮舒张等多个途径参与动脉粥样硬化的发生发展，有助于从基因水平阐明冠心病的发生机制，对冠心病进行早期预防、早期诊断，为冠心病的防治提供新的理论依据。

[1] Rastaldo R，Pagliaro P，Cappello S，etal．Nitric oxide and cardiac function[J]．Life Sci，2007，81(10)：779-793．

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[8] Lusis AJ．Atherosclerosis[J]．Nature，2000，407(6801)：233-241．

(收稿：2014-12-10)

Association of MEF2A-P279L single nucleotide polymorphism

The Central Hospital of Xi’an (Xi’an 710003) Zhang Tao Mu Yudong Cao Yongsheng

(SNP) with plasma eNOS

Objectives：To investigate the relationship between the distribution of Myocyte enhancer factor 2A (MEF2A) gene P279L polymorphism and plasma level of eNOS in Han nationality in Chinese North -Western area. Methods：Three hundred and eighty five Han ethnic subjects .DNA was extracted by phenol and chloroform extraction.The serum of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) was measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Results：The level of eNOS showed significant difference in the sequence of PP, PL and LL genotypes(P<0.05),the levels of LL were significantly lower than those in the LP and PP, no significant difference between PL genotype(100.35±12.61pg/ml)and PP genotype(103.28±13.35 pg/ml)(P>0.05),but The level of eNOS between PL and PP showed an upward trend. Conclusion:MEF2A-P279L genetic variation results in a protective change in level of eNOS, L allele may have induced atherosclerosis.

@ MEF2A-P279L Gene expression Nitric-oxide synthase

*西安市科技计划基金项目(2011HM1115)

@肌细胞增强因子2A基因 基因表达 一氧化氮合酶

R543.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.04.016

△陕西省肿瘤医院检验科