细胞永生化机制及不同细胞永生化方法研究进展

黄今，杨融辉，马海英

(中国医科大学基础学院 病理生理学教研室，辽宁 沈阳 110001)

·综 述·

细胞永生化机制及不同细胞永生化方法研究进展

黄今，杨融辉，马海英

(中国医科大学基础学院 病理生理学教研室，辽宁 沈阳 110001)

永生化细胞是一种在理化刺激、基因突变、病毒感染等外界刺激下，可以在体外无限增殖的不衰老细胞株。细胞永生化机制有放射性因素、端粒-端粒酶激活、病毒基因转染及抑癌基因受抑制等学说。作者在总结细胞永生化原理的基础上阐述不同组织细胞永生化的技术方法及生长状态。

细胞永生化； 体外培养； 端粒酶； 病毒； 癌基因； 文献综述

细胞永生化是指细胞在体外培养的过程中，由于自身基因变化或者外界各种刺激因素，避免了正常细胞的衰老死亡过程，可以长期传代培养、无限分裂增殖[1]。对细胞永生化发生机制的研究虽然已经取得了很大的进展，但是不同细胞永生化的机制不尽相同。作者在总结细胞永生化基本机制的基础上探讨不同细胞永生化研究的进展。

1 细胞永生化机制

衰老死亡是一种正常的不可逆的细胞生理过程，细胞在不断增殖分裂的过程中会到达衰老期M1期和致死期M2期[2]，细胞会停止分裂并启动凋亡程序。此时如果细胞在某些原因诱导下，恢复基因的稳定性，则可以逃离衰老死亡的正常生理过程达到无限增值分裂的永生化状态。

1.1 放射性因素

自1996年有学者在核弹辐射后的人体表面发现可以无限增殖的上皮细胞后，通过电离辐射、核辐射、X射线等照射使细胞得到永生化的方法相继被成功研究出来[3]。通过对成功永生的细胞核型的分析，推测是由于放射性因素使细胞染色体重组，抑癌基因表达被抑制，促进延长细胞寿命的基因表达，使端粒长度得以维持，细胞衰老程序无法稳定进行，细胞可以无限增殖分裂[4]。

1.2 端粒-端粒酶激活

端粒是存在于真核细胞内染色体首尾末端，由简单重复的DNA序列和周围蛋白质构成的特有帽状结构，长度在5～15 bp，具有重要的生理功能，包括维持染色体结构和位置的稳定，防止染色体被化学酶降解，调节细胞正常功能和决定细胞寿命等[5]。端粒随着细胞不断分裂会持续丢失，到一定长度阈值后会启动基因损伤检测点，导致细胞停止分裂并走向衰老进程[6]。因此，端粒的长度是评价细胞衰老的指标之一。端粒酶是一种催化端粒自我复制，增加端粒长度的逆转录酶，同时也是调控细胞周期的重要生物因子。其功能是通过对自身RNA序列的转录形成新的端粒DNA序列，以补充缩短缺失的端粒，维持端粒的长度和细胞的无限分裂[7]。

正常细胞中活性端粒酶的水平很低并且受到细胞基因严格调控，在原代培养的细胞中发现，端粒酶阳性表达的细胞中人端粒酶逆转录酶(hTERT)的水平也很高。研究证明hTERT作为端粒酶的催化亚基，与相关蛋白结合可以激活端粒酶，延长体外细胞培养的生存周期，是端粒酶的正向调控因子[8]。因此，hTERT基因的表达激活是细胞永生化的重要步骤。

1.3 病毒基因转染

现有实验表明，将一些致瘤病毒如猴肾病毒SV40、EB病毒、乳头状疱疹病毒等转化到人正常细胞内，可以改变正常基因，使部分细胞成功渡过两个致死期，得到无限增殖的能力，达到永生化的状态[9]。

1.3.1SV40病毒 SV40病毒是一种由LT和st两种抗原及相关蛋白组成的简单真核病毒，由于其对细胞生长、转化、瘤化的高效性，目前已成为真核细胞生物工程实验的探针型实验工具[10]。SV40诱导细胞转化过程涉及很多因素，过程非常复杂，其中LT片段对转化的启动起到决定性的作用[11]。将SV40病毒导入目的细胞核内，细胞抑癌基因p53和pRb会与LT抗原片段上相关结合区域结合，使抑癌基因失效无法表达，从而防止细胞分裂停滞，使其无限增殖并表现出多种与肿瘤相关的转化显型[12]。

1.3.2EB病毒 EB病毒是一类含双股线性DNA的疱疹病毒，可以与体外培养的B淋巴细胞融合，通过病毒基因组内潜伏基因的显性表达，改变细胞生命周期[13]。有研究发现被转染的淋巴细胞内抑癌基因如p53的转录表达水平有所上升，但是细胞寿命未见缩短，证明EB病毒可以抑制抑癌基因发挥活性效应，具有使淋巴细胞永生化的潜力[14]。

1.3.3人乳头状瘤病毒(HPV) HPV是一种对上皮细胞有高度特异性的DNA病毒，因其可以转染上皮细胞增殖成乳头状瘤而引起学者广泛关注。在HPV的编码基因中，E6和E7基因是诱导细胞永生化的重要因素，其编码的转化蛋白不仅可以封闭抑癌基因发挥作用的活性分子结构，还可以通过对hTERT的调控而激活端粒酶活性[15]。有实验表明被HPV转染的上皮细胞内端粒的长度停止缩短并不断增长，使细胞增殖失控达到永生化[16]。

1.4 原癌基因与抑癌基因

真核细胞内存在众多原癌基因如c-myc、vsrc、c-Jun等可以通过编码活性蛋白分子来调控细胞增殖分裂分化等生理过程，其中c-myc是最早被发现的原癌基因，有许多与瘤化相关的功能区域，其转录表达的蛋白可以通过核膜进入细胞核与端粒酶逆转录酶的启动子结合位点特异性结合，诱导端粒酶mRNA快速表达，直接激活端粒酶活性，促进细胞进入永生化进程[17]。

真核细胞内在细胞永生化的过程中，存在多种抑癌基因如p53、pRb、BRCA1、DPC4等，通过等位基因隐性作用、抑癌基因的显性负作用等逐渐失去活性，细胞老化途径受到阻止。有实验证明端粒酶的活性与抑癌基因表达产物的下调有相关关系，推测抑癌基因的失活协同端粒酶的激活共同参与细胞永生化的进程[18]。

2 不同细胞永生化的方法及机制

虽然永生化的机制有相似之处，但同样的永生化方法并非适用于所有细胞，因此，有针对性地发展对特定细胞的永生化技术可以帮助传代次数少、增殖分裂慢的细胞增加细胞周期寿命，达到临床要求的治疗功效。

2.1 肝细胞永生化方法

由于先天性肝脏疾病和肝衰竭等肝疾病发病率增高、捐赠供体短缺，使得体外活性肝脏的临床价值越来越高。虽然肝脏代偿功能强大，体内处于分裂休眠期的肝细胞数量巨大，但由于肝细胞生长分裂与自身三维立体结构及内部微环境紧密相关，肝细胞体外培养难度高、成功率低、传代困难，因此对外源性永生化肝细胞的研究是如今临床研究的重点。

2.1.1抑癌基因敲除 鉴于抑癌基因对细胞周期的控制和诱导细胞衰老的机制，有实验证明经过抑癌基因如p53等敲除后的体外肝细胞可以突破正常的细胞周期生长抑制极限，进入到无限增殖的状态。永生化肝细胞进行特异性分化、基因表达和表型与体内肝细胞基本相同。这种实验思路在小鼠肝细胞实践中已经获得了成功的实验案例，基因敲除的外源性培养肝脏移植到小鼠体内可以定植生长，但是基因缺失的细胞介于正常细胞与癌细胞状态之间，其瘤化几率以及基因稳定性问题还未得到圆满解决[19]。

2.1.2质粒转导和病毒转染 鉴于端粒-端粒酶学说对细胞永生化的可行性，用多顺反子质粒载体以及逆转录病毒将hTERT基因导入正常肝脏细胞核内，使端粒酶逆转录酶基因整合到肝细胞基因内并稳定表达，经过特定的细胞培养环境可以得到端粒长度增加，细胞寿命增长的正常人源肝细胞，可以传代300代以上并且没有致瘤性，其表达产物如肝药酶、细胞色素、白蛋白等均与内源性肝细胞产物相同[20]。但是目的基因以外的病毒外源性基因对细胞正常生理功能的潜在影响问题还有待解决。

2.1.3可恢复性永生化 目前为了解决外源性基因以及病毒内靶基因意外无关序列对细胞的影响，提出了可恢复性永生化的思路，即导入永生化基因后在细胞增殖稳定表达出正常细胞产物后，在合适的细胞周期区间，使用特异性整合技术敲除导入的目的基因，使细胞初始化。有实验表明，在敲除永生化相关基因后，本该停止继续增殖的现象并未发生，反而细胞在特异性分化、分泌代谢等方面趋向成熟，并且在端粒长度、基因完整性等方面与内源性肝细胞极其相似[21]。

2.2 上皮细胞永生化方法

DNA致瘤病毒转染是目前上皮细胞永生化最常用的方法。HPV重要的转化蛋白是E6，将HPV导入上皮细胞中，E6表达的产物可以与p53蛋白相结合并通过细胞内水解酶将p53降解[22]。E6可以单独作用于细胞基因使端粒酶活性上升，加速端粒的自我复制。病毒转染对口腔上皮细胞、视网膜上皮细胞、胰腺上皮细胞等永生化研究已经取得一定进展，但是角化上皮细胞等细胞在病毒转染基础上还需要其他因子共同作用。

2.3 心肌细胞永生化方法

随着心肌梗死等心血管疾病的发病人数稳步攀升，心脏衰竭终末期的唯一治疗方法就是心脏移植，因此自体心肌细胞体外永生化培养具有很高的临床价值。

目前有实验通过P16慢病毒载体和可逆SV40病毒转导途径成功建立了永生化心肌祖细胞。用心肌细胞谱系标志作为评价标准来观察转导细胞的生长状态，发现转导后细胞不仅可以成功增殖分裂，抑制衰老周期，还具备心肌干细胞的分化潜能。也有实验表明心肌成纤维细胞经过HPV病毒转染后成功增加寿命，并正常表达与初级成纤维细胞相同的细胞特异性标志物、细胞因子等[15]。虽然特定心肌细胞株永生化具有巨大研发空间，但是由于心肌分化是一个涉及众多微环境因素的复杂过程，因此重建永生化心脏还存在许多困难。

2.4 胚胎滋养层细胞永生化方法

胚胎滋养层细胞对胚胎发育具有重要作用，建立体外永生化滋养层细胞株对建立分泌细胞模型、研究胚胎疾病毒理以及肿瘤的发生发展都有很大的临床价值。已有研究成功将HPV中E6和E7与端粒酶逆转录酶相结合建立表达载体导入山羊滋养层细胞，培养出的胚胎滋养层细胞不仅表现出较高的端粒酶活性，并且对hTERT基因表达非常稳定、无致瘤性，最高可以传代50代以上[23]。细胞具有初级滋养层细胞的一切形态功能，检测到金属基质蛋白酶(MMP-2)、绒毛膜促性腺激素、免疫因子等滋养层细胞特异性分泌因子，符合长寿命体外细胞模型的观察标准[24]。

目前还有研究发现，在母婴垂直传播乙型肝炎病毒(HBV)案例的母体中发现可自发永生化滋养细胞系HPT-8。推测这种自发永生化的细胞是宫内感染过程中HBV整合在滋养层细胞内与正常基因相互作用并稳定表达的结果。对HPT-8进行电镜观察、免疫组化和细胞学荧光分析显示，细胞的形态以及细胞内容物特征与正常细胞极其相似，并且发现滋养层细胞特有的胞间桥粒以及细胞角蛋白、碱性磷酸酶、各种特异性激素等细胞标志物。同时，HPT-8细胞表面也发现了HBV抗原[25]。这种病毒与滋养层细胞融合后表达的克隆衍生物提示病毒适当表达可以促进细胞的永生化进程。

另外，还有其他多种细胞也已成功培养出永生化细胞株如：B淋巴细胞在体外用EB病毒转染后培养出可以稳定表达IgG的细胞株；用SV40慢病毒转染人脐静脉内皮细胞获得与正常细胞形态学，特征性标志物无明显差别的永生化细胞株等。

3 展 望

细胞永生化是细胞研究的一个重要方向，通过对细胞永生化的研究，不仅有助于进一步了解细胞生长规律，探索细胞衰老原因，而且对明确肿瘤发生机制、促进解决器官移植问题有着重要意义。但细胞永生化的研究仍存在一些问题，如将病毒导入目的细胞后可能产生有害细胞产物，导致细胞安全性存在隐患；由于永生化细胞是体细胞向癌细胞过度的一种中间状态细胞，涉及癌基因的表达，其在体内的安全性也受到质疑。即使现在对肝细胞、心肌细胞等永生化研究已经有很大进步，但往往成本较高，成功率低，且对永生化心肌细胞等特定细胞的分化仍十分困难。如何开发出成本较低、安全性好且功能正常的永生化细胞也是重要的研究方向。

永生化胚胎滋养层细胞作为现代细胞工程学研究的新焦点，对探索胚胎疾病、建立体外细胞模型、明确肿瘤发生和细胞衰老机制有着极大的临床价值，但同时胚胎细胞的永生化也涉及伦理道德方面的问题，需要注意。

[1] OBINATA M.Immortalized cell lines with differentiation potentials:their establishment and possible application[J].Seikagaku，2008，80(1):5-12．

[2] SCHOSSERER M，GRUBECK-LOEBENSTEIN B，GRILLARI J.Principles of biological aging[J].Z Gerontol Geriatr，2015，48(3):285-294.

[4] CHILDS B G，BAKER D J，KIRKLAND J L，et al.Senescence and apoptosis:dueling or complementary cell fates？[J].EMBO Rep，2014，15(11):1139-1153．

[5] MOMBACH J C，BUGS C A，CHAOUIYA C.Modelling the onset of senescence at the G1/S cell cycle checkpoint[J].BMC Genomics，2014，15(Suppl 7):S7．

[6] BALDUCCI L，BLASI A，SALDARELLI M，et al.Immortalization of human adipose-derived stromal cells:production of cell lines with high growth rate，mesenchymal marker expression and capability to secrete high levels of angiogenic factors[J].Stem Cell Res Ther，2014,5(3):63．

[7] 庄金秋，梅建国，王文秀，等.细胞永生化技术及其应用研究进展[J].生命科学研究，2011，15(4):363-368．

[8] WANG L，XIAO H，ZHANG X，et al.The role of telomeres and telomerase in hematologic malignancies and hematopoietic stem cell transplantation[J].J Hematol Oncol，2014，20(7):61．

[9] KARLSSON J，LILLJEBJÖRN H，HOLMQUIST-MENGELBIER L，et al.Activation of human telomerase reverse transcriptase through gene fusion in clear cell sarcoma of the kidney[J].Cancer Lett，2015，357(2):498-501．

[10] PARK Y J，KIM E K，MOON S，et al.Human telomerase reverse transcriptase is a promising target for cancer inhibition in squamous cell carcinomas[J].Anticancer Res，2014，34(11):6389-6395．

[11] 盖维，戴春，吕昌云.骨髓间充质干细胞对糖尿病肾病大鼠肾脏podocin表达的影响[J].现代医学，2014，42(10):1121-1126．

[12] 金光鑫，吴德全.间充质干细胞治疗肝脏疾病的研究进展[J].现代医学，2013，41(9):690-693．

[13] VILLOTA C,CAMPOS A，VIDAURRE S，et al.Expression of mitochondrial non-coding RNAs(ncRNAs) is modulated by high risk human papillomavirus (HPV) oncogenes[J].J Biol Chem，2012，287(25):21303-21315．

[14] STEPANENKO A A，KAVSAN V M.Immortalization and malignant transformation of eukaryotic cells[J].Tsitol Genet，2012，46(2):36-75．

[15] 汪廷乐，宋萌.人永生化细胞系模型建立的方法[J].上海口腔医学，2010，19(2):212-215．

[16] WANG M L，WALSH R，ROBINSON K L，et al.Gene expression signature of c-MYC-immortalized human fibroblasts reveals loss of growth inhibitory response to TGF-β[J].Cell Cy-cle，2011，10(15):2540-2548.

[17] 孟凡迎.人原代肝细胞的分离、培养及可逆性永生化[J].中华肝脏病杂志，2009，17(5):395-397．

[18] 潘小平.永生化人肝星状细胞系的建立及其对肝细胞功能与肝祖细胞分化的影响[D].杭州：浙江大学，2013．

[19] 马迪，严佶祺，彭承宏.肝细胞永生化研究进展[J].组织工程与重建外科杂志，2012，8(1):46-48．

[20] PAN X，WANG Y，YU X，et al.Establishment and characterization of an immortalized human hepatic stellate cell line for applications in co-culturing with immortalized human hepatocytes[J].Int J Med Sci,2015，12(3):248-255．

[21] 李爱民，王亚东，王泽楠，等.无病毒可回复性肝细胞永生化载体的构建和结构鉴定[J].现代消化及介入诊疗，2012，17(2):61-65．

[22] SIDDIQI S，SUSSMAN M A.The heart:mostly postmitotic or mostly premitotic？ Myocyte cell cycle，senescence，and quiescence[J].Can J Cardiol，2014，30(11):1270-1278．

[23] DONG F，HUANG Y，LI W，et al.The isolation and characterization of a telomerase immortalized goat trophoblast cell line[J].Placenta，2013,34(12):1243-1250．

[24] OMI H，OKAMOTO A，NIKAIDO T，et al.Establishment of an immortalized human extravillous trophoblast cell line by retroviral infection of E6/E7/hTERT and its transcriptional profile during hypoxia and reoxygenation[J].Int J Mol Med，2009，23(2):229-236．

[25] ZHANG L，ZHANG W，SHAO C，et al.Establishment and characterization of a spontaneously immortalized trophoblast cell line(HPT-8) and its hepatitis B virus-expressing clone[J].Hum Reprod，2011，26(8):2146-2156．

2015-05-02

2015-06-01

国家自然科学基金青年基金资助项目(31200730)

黄今(1993-)，女，辽宁沈阳人，在读硕士研究生。E-mail：632891329@qq.com

马海英 E-mail：1090955300@qq.com

黄今，杨融辉，马海英.细胞永生化机制及不同细胞永生化方法研究进展[J].东南大学学报：医学版，2015，34(5)：821-824．

R329.2

A

1671-6264(2015)05-0821-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.031