超声抗菌研究进展

于 勇，毕良佳

(哈尔滨医科大学附属第四医院 口腔科，黑龙江 哈尔滨150081)

众所周知，口腔内存在着数百种细菌，它们在口腔疾病发生发展的过程中扮演着重要角色，例如伴发于溃疡口疮等黏膜疾病的感染，菌斑导致的牙龈炎牙周炎和厌氧菌引发的根管深部炎症。针对口腔内的致病菌，药物治疗是目前广泛应用的治疗手段。

但在过去几十年，致病菌对抗生素的耐药性在公共健康领域已经成为一个棘手的问题［1］，并且与分散的细菌相比，菌斑生物膜更加耐药和难以被清除。研究表明菌斑复杂的结构，组成成分和可变的表面形态是其耐药性的根源［2-3］。尤其重要的是菌斑的结构，它决定了菌斑内部物质的运输过程，并形成具有特殊酸碱度和营养利用率的微环境［4］。因此，口腔的抗菌治疗需要除药物治疗以外其它的非创伤抗菌疗法。该疗法要拥有比药物更高的杀菌效率，可以局部应用，更小的毒副作用，更重要的是不易产生耐药性。经过长时间的探索，以超声为代表的声学抗菌成为研究的方向之一。

1 超声抗菌简介

自从Harvey 等［5］在1929年第一次提供超声能杀菌的证据之后，超声就开始作为一种灭菌方法被研究。由Scherba 等［6］在1991年首先提出超声的杀菌作用，实验显示浮游态大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌都被不同程度的杀灭，同时作者提出低频率超声杀菌的主要机制是空化效应。1994年，Pitt 等［7］提出超声联合抗生素的杀菌效果胜过单纯抗生素。1997年，O’Leary 等［8］发表了少有的关于超声对口腔细菌:伴放线杆菌和牙龈卟啉单胞菌的杀菌作用，它们是人类牙周疾病的主要致病菌。研究显示超声清创术和超声刮治术(频率＜25 kHz)在活体内消灭了菌斑生物膜。

由于抗菌实验中超声的参数众多，为了便于对研究结果的横向比较，多数学者将治疗性超声依据强度划分为低强度(＜3 W/cm2)和高强度(＞5 W/cm2)超声，依据频率又分为低频(＜500 kHz)和高频(＞500 kHz)超声［9］。

空化效应被认为是超声杀菌的主要机制。该效应的作用原理可以理解为入射声波的高低声压周期引起液体中微泡的扩大和缩小，细菌因此受到微泡周边剪切力的作用。微泡破碎所产生的高温又可将水和其它分子变成自由基，从而产生杀菌物质如过氧化氢。

此外经过研究发现低频超声能促进药物在菌斑中的渗透，促渗作用是超声联合抗生素时提高抗生素杀菌效果的主要机制［10］。

2 超声抗菌新进展

由于空化效应是超声杀菌的主要机制，学者大多针对空化效应展开探索，此外，在低频超声促渗效应等其他方面也有报道。

2.1 超声的空化效应

在超声靶向破坏微泡(ultrasound targeted microbubble destruction，UTMD)增强万古霉素对表皮葡萄球菌膜杀伤效果的研究中，经超声(80 kHz，1.0 W/cm2)作用10 min 菌膜即产生了微孔。菌膜密度和活菌计数相比对照组有明显降低［11］。同样在超声微泡联合万古霉素对抗表皮葡萄球菌生物膜的实验中，超声(300 kHz，0.5 W/cm2)增强了生物膜对万古霉素的敏感性，单纯的微泡即能对生物膜产生破孔作用。根据以上研究，UTMD 增强了生物膜的通透性，从而使抗生素的杀菌效果明显提高［12］。

类似的微气泡介导超声(microbubble-mediated ultrasound，MUS)同样增强了庆大霉素杀伤大肠杆菌的效果，MUS 组活菌计数有显著降低。单纯超声组和MUS 组庆大霉素的最小抑菌浓度显著低于对照组和单纯微泡组。可能的机制是空化作用增加了大肠杆菌细胞膜对庆大霉素的通透性［13］。

微泡破裂产生的力被认为是超声灭活微生物能力的来源。为了验证以上理论，Gao 等［14］分别用两种细胞壁来抵抗应力，并且由多种强度和作用时间的超声产生不同的微泡数量。应用20 kHz 的超声作用于杆菌属的产气肠杆菌和酵母菌属的短梗霉菌。实验结果显示，两种微生物的数量都随着超声作用时间的增加呈线性减少，且死亡率与超声强度正相关。同一课题组应用低频超声(20 kHz)，作用于悬浮态的产气肠杆菌和枯草杆菌产生了明显的杀伤效果。并且发现超声对于产气肠杆菌在对数生长期的作用效果比稳定期更显著，该团队认为细菌对于超声灭活的抵抗力主要来源于荚膜的厚薄［15］。

Lentacker 等［16］指出，超声和微泡加强了药物的运输。微泡在细菌胞膜上可以产生临时的孔洞，由此产生了声孔效应，增强了细菌胞体对药物的内吞作用。低强度的超声产生稳定的空化效应，使细菌的内吞作用得到活化。高强度超声产生微泡的破裂效应，在细菌胞膜上形成孔洞，增强细菌对药物的吸收。

2.2 超声抗菌的其它效应

低频超声对生物膜有促渗作用，多联合药物应用。在对眼角膜的促渗试验中应用强度0. 8 W/cm2，频率400 kHz 和600 kHz 的超声作用于眼角膜5 min。400 kHz 超声组房水中的药物量较对照组增加了2.8 倍，600 kHz 组增加了2.4 倍，虽然两组频率相近，但实验中低频超声较高频超声具有更强的促渗能力。增加了药物透过角膜向眼内渗入的量，该实验有效诠释了低频超声对生物膜的促渗作用［17］。

在牙体牙髓治疗领域，对于根管中的粪肠球菌生物膜，超声联合光动力的治疗显著减少了菌量，超过99%的粪肠球菌被杀死。研究者认为由于菌外基质的存在光敏剂仍然难以进入菌斑内部，超声除加强了光敏剂进入菌膜的能力还进一步活化光敏剂［18］。该实验也显示出超声可以增强细菌的内吞作用和细胞膜的通透性。

在创口感染中，菌斑生物膜也扮演了关键角色。超声辅助清创装置(ultrasonic - assisted wound debridement device，UAW)能有效的破坏模拟创口感染的金黄色葡萄球菌半固态生物膜。并且在使用防腐消毒剂之前应用UAW 更有利于减少细菌的数量［19］。

3 声动力疗法

近几年，在单纯超声抗菌的基础上，声动力疗法(sonodynamic therapy，SDT)从一种抗癌细胞的手段，逐渐被应用到抗菌领域中。SDT 是一种依靠超声激活声敏剂，产生对细胞有毒性的活性氧(reactive oxygen species，ROS)从而杀死细胞的方法［20］。目前应用较多的声敏剂多来自光敏剂［21］，如下文提到的血卟啉单甲醚(hematoporphyrin monomethyl ether，HMME)，可以被超声和特定波长的光激发。因SDT 是一种有潜力的抗菌方法，学者们又将其称为声动力抗菌化学疗法(sonoantimicrobial chemotherapy，SACT)。得益于超声优良的渗透效果，SACT 有望成为针对口腔深部感染，例如位于深牙周袋或者根管深部的病灶的有效治疗手段［22］。

4 声动力抗菌新进展

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin - resistant staphylococcus aureus，MRSA)是临床难治性感染的重要原因。Wang 等［23］用频率1 MHz 强度1.56 W/cm2的超声作用MRSA 悬液5 min，姜黄素为声敏剂。通过对菌落形成单位(colony forming units，CFUs)的计数评估细菌数量的多少。结果显示超声介导的姜黄素对MRSA 有明显的杀伤效果。作者提出可能的机制是超声致敏细菌从而促进了姜黄素对细菌DNA 的破坏效果，同时增加了跨细胞膜的物质输送导致细菌的DNA 更易受到损伤。同一团队应用相同参数超声和声敏剂对蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌进行灭活实验，乏氧组的细菌幸存率高于正常氧含量组，声动力的灭菌能力显示出对氧环境的依赖。此印证了SACT 是通过超声，声敏剂和ROS 的联合作用来达到杀菌目的，乏氧环境抑制了活性氧的产生从而降低SACT 的杀菌效率。此外该团队认为细菌的细胞壁也是影响杀菌效果的重要原因。革兰阴性菌比革兰阳性菌有更多的细胞外组织，因此更耐杀菌剂［24］。

口腔抗菌方面，Zhuang 等［25］在20 只大鼠的口腔内人造牙周炎模型，以HMME 为声敏剂，超声(1 W/cm2，1 MHz)作用30 min 后，SDT 组的组织学评价比对照组显示出更少的骨丧失。由此推断HMME 介导的SDT 能有效减轻大鼠牙周炎引起的牙槽骨破坏。间接反映出SDT 对牙周炎病原菌的杀灭作用。此外该研究还反映出SDT 继承了超声良好的穿透性，体现出对一定深度组织内的病灶的治疗能力。同一团队还探究了HMME 介导的SACT对金黄色葡萄球菌的影响。在HMME 浓度50 μg/mL，超声强度6 W /cm2频率1 MHz 的条件下，通过对CFUs 的计数显示SACT 组95%的细菌被杀灭，同样参数的单纯超声只造成了38%的菌量减少，单纯声敏剂组菌量无变化。本实验体现出针对悬浮菌，SDT 显现出超越单纯超声的灭菌能力。此外，在声动力治疗中，更高的HMME 浓度和更强的超声强度能杀死更多的细菌［26］。同样的Nakonechny 等［27］应用28 kHz 的超声，玫瑰红为声敏剂，对革兰阳性的金黄色葡萄球菌和革兰阴性的大肠杆菌进行灭活实验。不同浓度的玫瑰红和超声处理时间造成细菌浓度减少3 ～4 log10。

5 总 结

超声抗菌从最初针对悬浮态致病菌，到关注低频超声对菌斑生物膜的促渗作用，经过长时间的发展，超声在解决菌斑生物膜模型的灭菌难题上体现出一定的优势，在促渗作用之后超声介导微泡成为穿透菌斑的又一途径和研究热点。而SDT 在抗菌领域的研究虽处于起步阶段，但在对悬浮态细菌模型的灭菌效果较超声已经体现出优越性，不过对菌斑的作用效果目前尚缺乏报道。SDT 继承了超声的无创性和一定的组织穿透性，在之前抗癌研究中表现出对健康组织细胞具有生物安全性，因此SDT 是很有潜力和研究价值的抗菌新手段。此外，因声敏剂多来自光敏剂，使声光动力抗菌化学疗法(sonophotodynamic antimicrobial chemotherapy，SPACT )成为可能，声光动力联合治疗也许是未来一个有意义的研究方向。

［1］ Laxminarayan R，Duse A，Wattal C，et al. Antibiotic resistance-the need for global solutions［J］. Lancet Infect Dis，2013，13(12):1057 -1098.

［2］ Eastman JM，Harmon LJ，La HJ，et al.The onion model，a simple neutral model for the evolution of diversity in bacterial biofilms［J］.J Evolution Biol，2011，24(11):2496 -2504.

［3］ Stewart PS. Mini-review:convection around biofilms［J］.Biofouling，2012，28(2):187 -198.

［4］ Koo H，Falsetta ML，Klein MI. The exopolysaccharide matrix:a virulence determinant of cariogenic biofilm［J］. J Dent Res，2013，92(12):1065 -1073.

［5］ Harvey EN，Loomis AL. The destruction of luminous bacteria by high frequency sound waves［J］.J Bacteriol，1929，17(5):373 -376.

［6］ Scherba G，Weigel RM，O＇Brien WD Jr. Quantitative assessment of the germicidal efficacy of ultrasonic energy［J］.Appl Environ Microbiol，1991，57(7):2079 -2084.

［7］ Pitt WG，McBride MO，Lunceford JK，et al. Ultrasonic enhancement of antibiotic action on gram-negative bacteria［J］. Antimicrob Agents Chemother，1994，38(11):2577 -2582.

［8］ O＇Leary R，Sved AM，Davies EH，et al. The bactericidal effects of dental ultrasound on Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis. An in vitro investigation［J］. J Clin Periodontol，1997，24(6):432 -439.

［9］ Erriu M，Blus C，Szmukler -Moncler S，et al. Microbial biofilm modulation by ultrasound:Current concepts and controversies［J］. Ultrason Sonochem，2014，21(1):15 -22.

［10］ Carmen JC，Nelson JL，Beckstead BL，et al. Ultrasonic-Enhanced Gentamicin Transport through Colony Biofilms of Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli［J］. J Infect Chemother，2004，10(4):193-199.

［11］ He N，Hu J，Liu H，et al. Enhancement of Vancomycin Activity against Biofilms by Using Ultrasound - Targeted Microbubble Destruction［J］. Antimicrob Agents Chemother，2011，55(11):5331 -5337.

［12］ Dong Y，Chen S，Wang Z，et al. Synergy of ultrasound microbubbles and vancomycin against Staphylococcus epidermidis biofilm［J］. J Antimicrob Chemother，2013，68(4):816 -826.

［13］ Zhu HX，Cai XZ，Shi ZL，et al. Microbubble-Mediated Ultrasound Enhances the Lethal Effect of Gentamicin on Planktonic Escherichia coli［J］. Biomed Res Int，2014，2014(1):85 -117.

［14］ Gao S，Lewis GD，Ashokkumar M，et al. Inactivation of microorganisms by low - frequency high - power ultrasound:2. A simple model for the inactivation mechanism［J］. Ultrason Sonochem，2014，21(1):454 -460.

［15］ Gao S，Lewis GD，Ashokkumar M，et al. Inactivation of microorganisms by low - frequency high - powerultrasound:1. Effect of growth phase and capsule properties of the bacteria［J］. Ultrason Sonochem，2014，21(1):446 -453.

［16］ Lentacker I，De Cock I，Deckers R，et al. Understanding ultrasound induced sonoporation:Definitions and underlying mechanisms［J］. Adv Drug Deliver Rev，2014，72(6):49 -64.

［17］ Nabili M，Shenoy A，Chawla S，et al. Ultrasound -enhanced ocular delivery of dexamethasone sodium phosphate:an in vivo Study［J］. J Therapeutic Ultrasound，2014，2(6):1 -13.

［18］ Tennert C，Drews AM，Walther V，et al. Ultrasonic activation and chemical modification of photosensitizers enhances the effects of photodynamic therapy against Enterococcus faecalis root-canal isolates［J］. Photodiag Photodynam Ther，2015，12(2):244 -251.

［19］ Crone S，Garde C，Bjarnsholt T，et al. A novel in vitro wound biofilm model used to evaluate low -frequency ultrasonic - assisted wound debridement［J］. J Wound Care，2015，24(2):64，66 -69，72.

［20］ Harris F，Dennison SR，Phoenix DA. Sounding the death knell for microbes?［J］. Trends Mol Med，2014，20(7):363 -367.

［21］ Harris F，Dennison SR，Phoenix DA. Using sound for microbial eradication-light at the end of the tunnel?［J］.FEMS Microbiol Lett，2014，356(1):20 -22.

［22］ Serpe L，Giuntini F. Sonodynamic antimicrobial chemotherapy:First steps towards a sound approach for microbe inactivation［J］. J Photochem Photobiol B Biology，2015，150:44 -49.

［23］ Wang X，Ip M，Leung AW，et al. Sonodynamic inactivation of methicillin - resistant Staphylococcus aureus in planktonic condition by curcumin under ultrasound sonication［J］. Ultrasonics，2014，54(8):2109 -2114.

［24］ Wang X，Ip M，Leung AW，et al. Sonodynamic action of curcumin on foodborne bacteria Bacillus cereus and Escherichia coli［J］. Ultrasonics，2015，62:75 -79.

［25］ Zhuang D，Han J，Bi L，et al. Sonodynamic effect of hematoporphyrin monomethyl ether on ligature-induced periodontitis in rats［J］. Drug Des Dev Ther，2015，6(9):2545 -2551.

［26］ Zhuang D，Hou C，Bi L，et al.Sonodynamic effects of hematoporphyrin monomethyl ether on Staphylococcus aureus in vitro［J］. FEMS Microbiol Lett，2014，361(2):174 -180.

［27］ Nakonechny F，Nisnevitch M，Nitzan Y，et al. Sonodynamic Excitation of Rose Bengal for Eradication of Gram-Positive and Gram - Negative Bacteria［J］. Biomed Res Int，2013，2013:684930.