基因组编辑技术为彻底清除体内人类免疫缺陷病毒带来曙光

摘 要：迄今为止，获得性免疫缺陷综合征（AIDS）在全球仍是非常严重的传染病，没有彻底治愈的疗法。抗病毒疗法可抑制人类免疫缺陷病毒（HIV）复制，但不能彻底清除潜藏在人基因组中的HIV基因组序列。最近，基因组编辑技术如锌指核酸酶（ZFN）技术、类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）技术和成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR－Cas）技术被发现可成功破坏整合在人基因组中的HIV基因组序列，并成功诱导HIV辅助受体C－C趋化因子受体5（CCR5）缺失突变，而这种突变可抵抗HIV进入细胞。基因组编辑技术的成功应用将为治愈AIDS带来曙光。

基金项目：南开大学人才启动经费（ZB15006101）

通信作者：魏民

Corresponding author.WEI Min，E－mail：minwei19@163.com

Glimmers of success in eradication of human immunodeficiency virus in human bodies by CRISPR－Cas system

WEI Min 1，SHAO Yi－Ming 2

1.School of Medicine，Nankai University，Tianjin 300071，China；2.Division of Research on Virology and Immunology，National Center for AIDS／STD Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China

Abstract：Acquired immunodeficiency syndrome（AIDS），still a serious infectious disease，causes global epidemic and remains incurable until now.The current available antiretroviral therapy successfully inhibits human immunodeficiency virus（HIV）replication，but cannot eradicate the genome－integrated HIV. Recently，genome editing techniques，such as zinc finger nucleases（ZFNs），transcription activator－like effectors nucleases（TALENs），clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）and CRISPR－associated proteins（Cas）（CRISPR／Cas system），have been found to successfully disrupt the integrated HIV－1genes.Furthermore，genome editing techniques also have successfully induced C－C chemokine receptor type 5（CCR5）Δ32 mutation，a mutation of HIV entry co－receptor CCR5that is resistant to HIV infection.Therefore，genome editing techniques bring the glimmers of success in eradication of HIV in human bodies.

Key words：Human immunodeficiency virus；Cure；Zinc finger nuclease；Transcription activator－like effector nuclease；Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）and CRISPR－associated protein

由人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）引起的获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）在全球已流行30多年。据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）报道，截至2013年底，全世界约有3 500万HIV感染者，其中2013年新发HIV感染者约210万，当年死于AIDS者约150万 ［1］。到目前为止，仍没有有效的HIV疫苗 ［2］。虽然抗反转录病毒药物及抗反转录病毒治疗（antiretroviral therapy，ART）已取得很大进展，能有效控制病毒复制，但仍不能彻底清除病毒，不能治愈AIDS ［2］，因此治愈AIDS依然是世界科学家努力奋斗的目标。

2009年，德国医师报道，柏林1例名为Timothy Brown的HIV感染者在诊断HIV感染10年并接受ART 4年后，诊断出患有急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML） ［3］。医师为他进行了异体干细胞移植，干细胞移植的供者是CC趋化因子受体5（C－C chemokine receptor type 5，CCR5）Δ32纯合子。CCR5是HIV－1进入细胞的重要辅助受体，CCR5Δ32纯合子为双等位基因CCR5编码区第185位氨基酸后32个碱基发生缺失，对HIV感染具有抗性。患者在停止ART 20个月并接受2次干细胞移植后，没有发现病毒反弹 ［3］。更重要的是，停药6年以后，仍未发现病毒反弹 ［4］。这是世界上第1例被认为治愈的HIV感染者，或称为功能性治愈，即停止ART后无病毒反弹。该病例虽是特例，却燃起了人们治愈AIDS的希望！

另外一个例子是及早治疗的病例。在美国密西西比州，1例HIV感染新生儿刚出生30h，医师即为她进行ART，直至患儿18个月停止。停药后，至患儿30个月体内仍没有检测到病毒，曾被认为“功能性治愈” ［5］。但在2014年，即停药2年后，该患儿体内重新检测到病毒，不得不恢复ART。这对AIDS的研究是一次重大打击，刚刚燃起的治愈AIDS的希望受到重创 ［6］。

1　HIV潜伏机制

HIV属反转录病毒科慢病毒属，与人细胞表面CD4受体结合，在CCR5或CXCR4等辅助受体的协同作用下，进入人体CD4 ＋T细胞或巨噬细胞等 ［7］。进入细胞后，HIV脱壳，在病毒反转录酶作用下合成病毒DNA。在病毒整合酶作用下，整合至宿主细胞基因组中，成为前病毒DNA（proviral DNA）。前病毒DNA可潜伏，形成病毒潜伏库（reservoir）；或被激活，合成新的病毒蛋白，经过组装、出芽，最后释放出成熟的病毒颗粒，开始下一轮病毒复制周期 ［7］。

HIV潜伏库在病毒感染2～3d，甚至在血浆和淋巴结中还没有检测到病毒时就已形成 ［8］。长期以来，静息的、长期的记忆CD4 ＋T细胞（quiescent long－term CD4 ＋memory T cell）被认为是HIV的主要潜伏库 ［9］。最近研究表明，骨髓造血干细胞（hematopoietic stem cell）也可被HIV感染并潜伏。HIV进入骨髓造血干细胞主要依靠CXCR4辅助受体，而CXCR4辅助受体是造血干细胞分化的主要刺激因子 ［10］。这也部分解释了为什么在AIDS晚期或疾病快速进展时，HIV从CCR5嗜性转变成CXCR4嗜性 ［10］。进入骨髓造血干细胞的HIV，可被一些细胞因子激活，随着细胞增殖、分化而复制，因此造血干细胞是另一个重要的病毒潜伏库。上述德国柏林患者在接受干细胞移植前后，HIV主要是CCR5嗜性，只有很少量的CXCR4嗜性病毒，这也解释了为什么停药6年后他没有出现病毒反弹 ［11］。

HIV的潜伏状态还与HIV的转录调控有关。HIV通过自身编码的转录反式激活因子（transactivator of transcription，Tat）反式激活HIV长末端重复序列（long terminal repeat，LTR）区的反式激活反应元件（trans－activation response element，TAR）以启动转录 ［12，13］。除Tat蛋白外，HIV的转录调控还受细胞因子的调控，如正向转录延伸因子b（positive transcription elongation factor b，PTEFb）中的细胞周期蛋白依赖性激酶9（cyclindependent kinase 9，cdk9）和人细胞周期蛋白T1 （human cyclin T1）、细胞核转录因子——核因子κB（nuclear factorкB，NF－кB）、负向转录调控因子CTIP2（COUP－TF interacting protein 2）、DRB敏感性诱导因子（DRB－sensitivity inducing factor，DSIF）、负性延伸因子（negative elongation factor、NEL） ［12，13］。从表观遗传学方面来看，HIV转录还受组蛋白的调控，包括组蛋白的乙酰化、甲基化，DNA的甲基化等 ［12，13］。总之，在转录水平上决定HIV处于潜伏状态还是活化状态受多种因子的调控。

除潜伏外，另一个HIV可在抗病毒疗法下存活的原因是病毒依然可复制。病毒复制可在一些药物很难到达的地方，如脑（很多药物通不过血脑屏障）、睾丸、宫颈、肠道相关淋巴组织（gut－associated lymphoid tissue，GALT）等。在药物压力下，HIV还可进行细胞－细胞间传播（cell－to－cell transmission） ［8］。HIV的潜伏及药物压力下的病毒复制成为停药后病毒反弹的主要原因 ［8］。

2　基因组编辑技术

基因组编辑技术，包括锌指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）技术、类转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator－like effector nuclease，TALEN）技术和成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白﹝clustered regularly interspaced short palindromic repeat（CRISPR）and CRISPR－associated protein，CRISPR－Cas﹞技术。

ZFN技术是最先应用的基因组编辑技术，早在1996年就被采用 ［14］。利用ZFN可特异性结合DNA的特点，几个特异性ZFN串联在一起即可识别一段DNA，同时又串联了限制性内切酶FokⅠ非特异性剪切结构域，这样可对识别位点进行切割，造成双链断裂（double－stranded DNA break，DSB），通过同源重组（homologous recombination）或非同源末端连接（non－homologous end joining，NHEJ）达到精确编辑或碱基突变的目的 ［14，15］。

TALEN技术是基于植物病原菌——黄单胞菌（Xanthomonas）分泌的类转录激活因子效应物（transcription activator－like effector，TALE）设计和构建的，由特异性的DNA结合域和非特异性的限制性内切酶FokⅠ两部分组成。与ZFN技术相似，TALEN可特异性结合靶DNA序列，并在特定位点对DNA双链进行切割，形成DSB。与ZFN技术相比，TALEN技术具有更高的DNA识别效率 ［16］。

最近，CRISPR－Cas技术成为新一代基因组编辑技术 ［17］。CRISPR最早发现于1987年，当日本学者在研究碱性磷酸酶时，意外地在其下游发现了高度保守的可形成发夹结构的29个碱基组成的DNA重复序列，这些重复序列被32个碱基分割开，也称间隔序列（spacer） ［18］。后来，对大量细菌基因组进行测序发现，在超过40%的细菌和超过90%的古细菌（archaea）中含有CRISPR序列 ［17］。

2005年，CRISPR中的间隔序列被发现来源于专门感染细菌的病毒——噬菌体 ［17，19］。这一发现使人们推测CRISPR的功能可能是细菌用于防御噬菌体感染的免疫机制。2007年，Barrangou首次实验证实了添加或去除间隔序列可决定细菌对噬菌体的抗性；细菌对噬菌体的抗性取决于间隔序列与噬菌体基因的相似性及Cas蛋白 ［20］。随着越来越多的CRISPR基因位点及Cas蛋白被发现，根据比较基因组学和Cas蛋白基因同源性系统进化树分析，2011年CRISPR－Cas系统被分成3类，这3类全部含有Cas1（DNase酶）和Cas2蛋白（核糖核酸内切酶，endoribonuclease）。其中，Ⅰ类CRISPR－Cas系统还含有Cas3蛋白，也是最复杂的系统，又分成许多亚类；Ⅱ类CRISPR－Cas系统含有一个大的Cas9（核酸酶，nuclease）蛋白；而Ⅲ类CRISPR－Cas系统含有Cas10、Cas6等蛋白 ［21］。

目前，CRISPR的功能已基本清楚，是细菌防御噬菌体或质粒入侵的获得性免疫机制 ［17］。大致分成3个步骤：①噬菌体或质粒入侵细菌。Cas蛋白通过识别原型间隔序列（proto－spacer），将间隔序列整合入自身基因组CRISPR中，这一过程称为间隔序列的获得。间隔序列被细菌自身重复序列隔开，使细菌区分自我与非我。②CRISPA RNA （crRNA）的转录加工。crRNA首先转录合成前体crRNA（pre－crRNA），其中Ⅰ类和Ⅲ类CRISPRCas系统在相关Cas蛋白核糖核酸内切酶作用下，剪切得到成熟crRNA；而Ⅱ类CRISPR－Cas系统的crRNA前体，还需借助与重复序列互补的反式激活crRNA（trans－activating crRNA，tracrRNA）结合形成二聚体，被RNaseⅢ和其他核酸酶切割，得到成熟crRNA。③目的片段的降解。成熟的crRNA与入侵的噬菌体或质粒DNA目的片段经碱基互补配对结合，引导Cas蛋白对目的片段切割和降解，完成免疫防御功能 ［17，21］。

这3类CRISPR－Cas系统中，Ⅱ类研究得较为清楚，只需crRNA、tracrRNA和Cas9核酸酶复合物。有学者将crRNA与tracrRNA连接在一起，构成引导RNA（guide RNA，gRNA） ［17］。Cas9核酸酶并不降解目的DNA，但可在目的DNA片段造成DSB。Cas9核酸酶识别5′－NGG－3′特征序列，该序列称为原型间隔序列毗邻基序（proto－spacer adjacent motif，PAM）。这样在gRNA 5′－NGG－3′下游设计一个长20个碱基、与目的DNA互补的序列，一条gRNA就可引导Cas9对靶向基因组DNA进行切割，一对gRNA就可引导Cas9对目的片段进行双切割，达到基因敲除目的。切割后的DNA在同源重组或非同源末端连接机制下进行修复，引入插入或缺失 ［17］。

CRISPR－Cas9技术出现后得到广泛应用，成功用于斑马鱼、小鼠甚至大鼠基因敲除 ［17，22，23］。CRISPR－Cas9技术比以前的基因组编辑技术如ZFN和TALEN技术具有更高的效率 ［17］。一项研究表明，CRISPR－Cas9技术比TALEN技术在诱导CCR5Δ32缺失同源重组方面效率高3倍 ［24］。

3　基因组编辑技术在抗AIDS中的应用

2013年，我国复旦大学朱焕章教授课题组成功应用ZFN技术，针对HIV两端LTR区，对整合到人基因组中的前病毒HIV进行了清除 ［25］。另外，还有2项研究应用CRISPR－Cas9技术针对整合到人基因组中的HIV，设计gRNA与HIV LTR结合，成功进行了前病毒HIV的清除 ［26，27］。一项研究甚至清除了HIV全长基因9 709bp ［27］。而且，带有CRISPR－Cas9和针对HIV的gRNA系统可抵抗新的HIV感染 ［27］，这与CRISPR－Cas系统是细菌抵抗噬菌体入侵的功能相似。

上述研究是针对HIV本身，还有研究针对病毒的辅助受体CCR5。有研究用CRISPR－Cas9系统或ZFN和TALEN技术，成功诱导CCR5缺失突变，可抵抗HIV感染 ［21］。一项应用ZFN技术修饰CCR5的研究已进入临床试验，该研究将患者CD4细胞在体外用ZFN技术修饰，然后自体回输，证实是安全的 ［28］。

4　结语

前述德国患者在接受异体干细胞移植后，停止ART 6年后没有出现病毒反弹，为治愈AIDS带来希望。而密西西比州的婴儿，ART并没能阻止病毒反弹。至少，到目前为止，不管使用何种抗病毒药物组合，包括已批准使用的反转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和整合酶抑制剂，无论早期治疗还是晚期治疗，药物疗法仍未能治愈AIDS。

异体干细胞移植对AIDS合并白血病或淋巴瘤的患者是可行的，但不可能对未合并白血病的AIDS患者进行异体干细胞移植。此外，异体移植还有基因配型的问题，应选择CCR5Δ32缺失纯合子，这种突变在中国人中很少，只有0%～0.19% ［29］，在欧美白人中仅有4%～10% ［24］。

对于AIDS患者，通过基因组编辑技术将CD4细胞在体外进行CCR5诱导突变和CXCR4修饰，然后自体回输，将是治愈AIDS非常有前景的研究方向。另外一个方向可针对HIV本身，应用基因组编辑技术引入人体进行基因治疗，也可能治愈AIDS。

基因组编辑技术的应用为治愈AIDS提供了广阔前景，但仍有很多问题需解决。如脱靶问题，虽然CRISPR－Cas9系统针对HIV的研究没有发现脱靶现象 ［24－27］，但由于个体差异和基因多态性，该技术在临床中的应用尚需进一步验证。另外，如果应用基因组编辑技术对AIDS患者进行基因治疗，如何导入人体仍是一个技术瓶颈。