药物淋巴细胞刺激试验在药物性肝损伤诊断中的意义

孙双双 傅青春 杨峻 程明亮 王晓今 倪鎏达 施莉琴 王琳 夏凡 陈成伟

随着人们对药物性肝损伤（DILI）的不断认识和新药的不断开发，DILI发生率明显上升，但DILI无特异性的诊断标志，药物激发试验存在一定风险和伦理学问题。药物淋巴细胞刺激试验是一种无创的体外诊断方法［1］。20世纪70年代，日本学者鉴于过敏特异质性肝损伤，建立了药物淋巴细胞刺激试验（DLST）并沿用至今。2004年的DDW－Japan会议上，日本肝病学会针对DILI诊断提出了新方案，在1993年Danan方案基础上增加了DLST。40多年来DILI的检测方法不断趋于成熟，但由于缺乏多地区、可重复性数据，尚未被美国食品与药品管理局（food and drugs administration，FDA）批准，陈高艳等［2］于2010年也建立了DLST方法并作了初步报道。本研究对诊断为DILI行DLST的患者进行分析，以进一步评价DLST在DILI诊断中的意义。

资料和方法

一、研究对象

收取2011年7月至2014年8月确诊为DILI 84例，疑诊DILI患者17例，非DILI患者17例（基础肝脏疾病14例，肺结核2例，甲状腺功能亢进1例），72例健康人作为对照。检测对象平均年龄51岁（15～89岁），男51例，女67例。DILI临床诊断依据为排除其他病因引起的肝损伤，经RUCAM评分并结合专家意见作出，部分患者取得肝组织证据。

二、方法

（一）提取PBMC细胞 新鲜全血5 mL，超净台中取5 mL淋巴细胞分离液Ficoll于15 mL无菌离心管内，将3 mL抗凝血小心沿管壁缓缓加入其中，3 000 r/min，离心30 min，吸取PBMC层，将吸取的PBMC打入另一15 mL无菌离心管中，加入1×PBS 10 mL洗涤细胞，2000 r/min，10 min，弃上清液，用10%FCS－RPMI－1640细胞培养液调整细胞浓度为1×106个/mL［3］。

（二）细胞点板布局 取96孔细胞培养板设计点板布局。实验设健康对照组、阳性对照组和DILI组（可疑药物按循环血量一次给药量的血药浓度计算），每组均设3复孔。健康对照组：100μL细胞悬液＋100μL细胞培养液；阳性对照组：100μL细胞悬液＋100μL PHA 稀释液（终浓度10μg/mL）；DILI组：100μL细胞悬液＋100μL配置的药物。将96孔板周边孔加满水，以防边孔效应，放入37°C、体积分数为0.05的CO2培养箱中继续培养。

（三）3H －TdR（thymidine）掺入 细胞培养52 h后每孔加入10μL3H－TDR继续培养至72 h，取出培养板，用多头细胞收集仪收集各孔细胞于“9999”型玻璃滤纸；烘干后滤纸放入含1.5 mL闪烁液的液闪瓶中，于SN－6930型液体闪烁计数器检测CPM值。

（四）结果判断 计算SI，SI＝（实验组均值－机器本底）/（对照组均值－机器本底），结果大于1.8为阳性。

三、统计学方法

采用SPSS17.0软件包处理数据。计量资料以均数±标准差表示，采用t检验，组间比较采用单因素方差分析，计数资料采用χ2检验，各指标动态曲线变化采用重复测量。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、DLST的总体检测结果

101例临床诊断或疑诊为DILI中 ，DLST阳性36例（35.6%），其中男15例，女21例；DLST阴性65例（65%），其中男33例，女32例。72例健康对照组中仅1例阳性，女性，27岁，作为对照投入药物为中药马勃，其服药史不详。临床诊断或疑诊为DILI 101例患者中，DLST检测的敏感度为35.6%，特异度为98.6%。敏感度可能还取决于所测试的药物对淋巴细胞致敏的程度。DLST阳性组和阴性组相比，性别差异无统计学意义（P＝0.667）。

二、DLST检测与临床分型

DLST阳性患者中肝细胞型16例（44.4%），混合型8例（22%），胆汁淤积型5例（13.8%），无法判断7例（19.4%）。DLST 阴性患者中肝细胞型30例（46.1%），混合型18例（27.6%），胆汁淤积型6例（9.2%），特 殊 型 1 例 （15.3），无 法 判 断 10 例（15.6%）。DLST在胆汁淤积型检出率偏低，但差异无统计学意义。

三、DLST与临床表现的关系

118例患者中临床表现伴发热16例，其中确诊及疑诊为DILI 15例（DLST阳性8例，DLST阴性7例），非DILI 1例；皮疹9例，其中确诊及疑诊为DILI 6例（DLST阳性3例，DLST阴性3例），非DILI 3例；关节酸痛8例，其中确诊及疑诊为DILI 6例（DLST阳性2例，DLST阴性4例），非DILI 2例；嗜酸粒细胞比例增高者20例，其中确诊及疑诊为DILI 18例（DLST阳性13例，DLST阴性3例），非DILI 4例；差异有统计学意义（P＝0.014），可见DLST与临床表现具有一定关联性。

四、DLST与RUCAM评分关系

按RUCAM量表诊断DILI，＞8分：非常可能；6～8分：很可能；3～5分：可能；1～2分：不象；≤0分：无关。DLST阳性RUCAM评分患者6分14例，7分12例，8分9例，9分1例，≤5分者DLST均为阴性。本组结果表明DLST阳性者集中在6～8分的很可能段。DLST与RUCAM评分结合，应可以提高DILI诊断的准确性。

五、DLST与抗结核药引起的DILI

因服用抗结核药诊断或疑诊为DILI 35例，其中DLST阳性16例（45.7%）异烟肼、利福平、利福喷丁、吡嗪酰胺、链霉素。DLST阳性与药物激发试验（drug provocation test，DPT）结果有6例是一致的（异烟肼、利福平、吡嗪酰胺各2例）完全与DPT结果相反的有3例，考虑个体差异，患者再次用药产生适应性反应，故需扩大样本进一步验证。

讨 论

DLST作为DILI的体外无创的诊断方法，最早用于诊断药物诱导的肺损伤及药物性肝病。Morii等［4］用DLST来诊断雌二醇导致的肝损伤。文献报道DLST敏感度各不相同［4－6］，本研究显示 DLST 敏感度为36%。有报道指出使用自身血清比AB血清敏感性要高［7］，在本研究中，起初使用小牛血清，改用AB血清发现敏感度较前有所提高，尚需扩大样本进一步检测验证。

本研究表明，DLST与RUCAM评分有较好的相关性。通过体外试验，评估过敏特异质性DILI患者肝损伤与目标药物之间的关系，可解决临床可疑肝损药物撤除和重新服用抉择上的无所适从。在目前尚无特异性诊断方法之前，DLST仍不失为一种可以作为主要诊断依据的方法。

本实验尚有值得改进的地方，如最早有人提出药物溶解度可以影响DLST的结果，随着技术的不断改进，这一问题也趋解决［8－10］。DLST 的结果与 DLST检测的时间具有一定的关联性［8］，若在DILI发生1～2周内检测DLST为阴性，间隔2～3个月后再次检测可能为阳性，其机制并不是很清楚，可能与T淋巴细胞增殖的时间有关［4、11］。因此，DLST对药物诱导的肝损伤尚有诊断的价值，但需进一步改良。

本试验成功建立了DLST。3H－TdR掺入法进行DLST检测的方法学较为稳定，可作为一种协助过敏特异质性DILI诊断的实验室检测方法。

1 Ikegame S，Wakamatsu K，Fujita M，Nakanishi Y，Kajiki A.A case of isoniazid－induced liver injury diagnosed by use of the DLST，and successful reintroduction of isoniazid for pleural tuberculosis.Journal of infection and chemotherapy：official journal of the Japan Society of Chemotherapy，2011，17：530－533.

2 陈高艳，陈成伟，等.药物淋巴细胞刺激试验建立（3H－TdR）及其药物性肝病诊断中的应用.中华肝脏病杂志，2012，3：190－192.

3 渡辺 真彰.薬物性肝障害におけるリンパ球刺激の診断的価値と診断 指針の評価.肝臓，2001，42：448－453.

4 Morii K，Nishisaka M，Nakamura S，Oda T，Aoyama Y，Yamamoto T，et al. A case of synthetic oestrogen－induced autoimmune hepatitis with microvesicular steatosis.Journal of clinical pharmacy and therapeutics，2014，39：573－6.

5 Suzuki Y，Miwa S，Shirai M，Ohba H，Murakami M，Fujita K，et al.Drug lymphocyte stimulation test in the diagnosis of adverse reactions to antituberculosis drugs.Chest，2008，134：1027－1032.

6 Matsuno O，Okubo T，Hiroshige S，et al.Drug－induced lymphocyte stimulation test is not useful for the diagnosis of druginduced pneumonia.Tohoku J Exp Med，2007，212：49－53.

7 Miwa S，Suzuki Y，Shirai M，et al.Drug lymphocyte stimulation test is not useful for side effects of anti－tuberculosis drugs despite its timing.INT J TUBERC LUNG DIS，2012，16：1265－1269.

8 Yano S，Kobayashi K，Kato K，Tatsukawa T，Shishido S.The usefulness of lymphocyte stimulation test（LST）in side effects of antituberculosis drugs.Kekkaku，2004，79：7－10.

9 Mikio SAITO，Motohiro YAGI，Katsuji UNO，et al.Comparative Study of the Usefulness of the Drug－Induced Lymphocyte Stimulation Test and the Leukocyte Migration Test in Drug Allergies.Biol.Pharm.Bull，2008，31：299－304.

10 Fontana RJ.Pathogenesis of Idiosyncratic Drug－Induced Liver Injury and Clinical Perspectives.YGAST，2014，146：914－928.e911.

11 Pichler WJ，Tilch J，The lymphocyte transformation test in the diagnosis of drug hypersensitivity Allergy，2004，59：809－820.