急性荨麻疹患者外周血Th17细胞数量和功能的变化

石教启，张继华

（阳新县人民医院检验科，湖北阳新 435200）

急性荨麻疹患者外周血Th17细胞数量和功能的变化

石教启，张继华

（阳新县人民医院检验科，湖北阳新 435200）

目的分析急性荨麻疹患者外周血辅助性T细胞17（Th17）细胞数量和功能的变化，探讨Th17细胞在急性荨麻疹免疫致病机制中的作用。方法收集50例急性荨麻疹患者和50例健康体检者外周血标本，流式细胞术分析其外周血Th17细胞数量，实时荧光定量PCR（qPCR）法分析其转录因子维甲酸相关孤儿素受体γt（RORγt）mRNA水平，酶联免疫吸附测定（ELISA）法分析其外周血Th17细胞相关细胞因子转化生长因子－β（TGF－β）、白细胞介素（IL）－6、IL－17A、IL－17F和IL－23水平。结果急性荨麻疹患者Th17细胞数量（t＝36.634 1，P＜0.05）和RORγt m RNA水平（t＝23.840 1，P＜0.05）明显高于对照组，Th17细胞相关细胞因子TGF－β（t＝15.521 1，P＜0.05）、IL－6（t＝7.247 3，P＜0.05）、IL－17A（t＝15.415 3，P＜0.05）和IL－17F（t＝13.032 1，P＜0.05）水平均明显高于对照组。结论Th17细胞可能通过分泌IL－17A、IL－17F和IL－6等炎症因子在急性荨麻疹发病过程中发挥作用。

急性荨麻疹； 辅助性T细胞17； 维甲酸相关孤儿素受体γt； 白细胞介素

荨麻疹是一种常见的、严重的过敏性疾病，是由皮肤、黏膜小血管扩张和通透性增加而导致的一种局限性水肿反应，临床主要表现为风团和红斑，亦可伴发腹痛腹泻，严重者可喉头水肿甚至休克［1］。辅助性T细胞17（Th17）是一群重要的介导炎症反应的细胞，分泌白细胞介素（IL）－17等促炎症因子，其免疫反应失调和多种免疫性疾病密切相关［2－3］，但Th17是否参与荨麻疹免疫致病机制目前尚不清楚。因此，本研究拟分析急性荨麻疹患者外周血Th17细胞数量及其相关细胞因子水平，探讨外周血Th17细胞数量和功能变化与急性荨麻疹的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2010年8月至2011年11月来本院皮肤性病科就诊的急性荨麻疹患者50例（急性荨麻疹组），男23例、女27例，平均年龄41.3岁（33～52岁）。50例同时期于本院体检者，排除免疫性疾病，作为对照组，男26例、女24例，平均年龄39.6岁（28～48岁）。急性荨麻疹诊断标准见文献［4］。

1.2 仪器与试剂 小鼠抗人CD4、IL－17荧光抗体和同型对照试剂购自美国eBioscience公司；莫能霉素、依诺霉素、十二豆蔻佛波醇乙醋（PMA）和皂素均购自Sigma公司；淋巴细胞分离液购自深圳达科为生物技术有限公司；Dynal磁珠mRNA抽提试剂购自北京思尔成生物技术有限公司；一步法实时荧光定量PCR（qPCR）通用试剂盒购自北京博奥生物有限公司；维甲酸相关孤儿素受体（RORγt）引物和荧光探针由上海生工生物工程有限公司设计和合成；TGF－β、IL－6、IL－17A、IL－17F和IL－23酶联免疫法试剂购自美国DRG公司；FACS Calibur型流式细胞仪为美国BD公司产品；Thermo Multiskan MK3型酶标仪为美国赛默飞世尔公司产品。

1.3 方法

1.3.1 外周血Th17细胞数量测定 无菌取研究对象肝素抗凝静脉血2 m L，充分混匀。取1 m L全血和1 m L含10%小牛血清的RPMI－1640培养液于12孔培养板中。加入依诺霉素、PMA和莫能霉素（终浓度分别为2μmol/L、8 nmol/L、2μmol/L），37℃、5%CO2培养4 h。收集培养物，800×103r/min离心5 min去上清，加入0.85%NH4Cl溶液溶解红细胞，PBS缓冲液洗涤两次。加入10μL CD4－FITC单抗或小鼠抗人IgGFITC，4℃混匀避光30 min，800×g离心5 min去上清。加入200μL皂素，室温20 min，PBS缓冲液洗涤两次。加入10μL IL－17－PE单抗或小鼠抗人IgG－PE，4℃混匀避光30 min，加入400μL 0.5%多聚甲醛固定，上流式细胞仪检测，以CD4－FITC设门，检测Th17（CD4＋IL－17＋）细胞百分率。

1.3.2 外周血Th17细胞转录因子测定 取研究对象EDTANa2抗凝静脉血4 m L，淋巴细胞分离液梯度离心法分离研究对象外周血单个核细胞，严格按试剂盒说明书抽提纯化mRNA，然后采用qPCR检测RORγt m RNA。

1.3.3 外周血Th17细胞相关细胞因子测定 取研究对象外周非抗凝血2 m L，分离血清，严格按试剂盒说明书检测诱导因子TGF－β和IL－6水平，以及效应因子IL－17A和IL－17F水平

1.4 统计学处理 采用SPSS14.0软件分析实验数据。计量资料以表示，两组间比较采用成组设计t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。。

2 结 果

2.1 急性荨麻疹患者外周血Th17细胞数量和转录因子RORγt m RNA水平 急性荨麻疹患者外周血Th17细胞百分率（t＝36.634 1，P＜0.05）和RORγt m RNA水平（t＝23.840 1，P＜0.05）均高于对照组，差异有统计学意义。见表1、图1。

2.2 急性荨麻疹患者外周血Th17细胞相关细胞因子水平急性荨麻疹患者外周血Th17细胞诱导因子TGF－β（t＝15.521 1，P＜0.05）、IL－6（t＝7.247 3，P＜0.05）和Th17细胞效应因子IL－17A（t＝15.415 3，P＜0.05）、IL－17F（t＝13.032 1，P＜0.05）水平均高于对照组，差异均有统计学意义，见表2。

表1 急性荨麻疹患者外周血Th17细胞百分率和RORγt m RNA水平（）

＊:P＜0.05，与对照组比较。

组别n Th17（%）RORγt mRNA （copies/m L）急性荨麻疹组50 6.41±1.15＊2 680±624＊对照组50 0.45±0.03 537±121

表2 急性荨麻疹患者外周血Th17细胞相关细胞因子水平（pg/m L，）

＊:P＜0.05，与对照组比较。

组别n诱导因子TGF－βIL－6效应因子IL－17A IL－17F急性荨麻疹组50 534.2±122.3＊230.1±99.3＊313.2±89.6＊323.5±108.3＊对照组50 220.8±73.5 100.3±78.6 97.1±42.4 100.3±54.2

3 讨 论

荨麻疹是一种变态反应性疾病，其发病中心环节是皮肤或黏膜组织肥大细胞脱颗粒，释放血管活性介质如组胺等，新合成的、胞膜来源的介质如白三烯、前列腺素等随后释放，造成平滑肌收缩、毛细血管扩张、通透性增加等，引起荨麻疹的临床表现［4］。

以往研究认为IgE介导的Ⅰ型超敏反应是荨麻疹发生的主要免疫机制，但近年来研究发现，Ⅰ型超敏反应并不能解释所有的荨麻疹，可能有更多的免疫功能紊乱状况参与了荨麻疹免疫发病机制［5－6］。研究发现以分泌炎症因子IL－17为主要特征的Th17细胞与器官移植排斥反应、肿瘤及类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、哮喘等炎症免疫性疾病有关，这些患者的血清和病变组织中都能检测到IL－17分子［7－8］。急性哮喘患者外周血Th17细胞表达增加，并且与疾病的严重程度呈正相关［9］；同样，系统性红斑狼疮患者外周血Th17细胞也明显增多，并且与病情活动性、肾脏损害程度及蛋白尿相关［10］；另有研究发现Th17功能亢进可能促进了急性胰腺炎的发生与恶化［11］。但Th17细胞是否参与荨麻疹免疫致病机制目前少有报道，本研究发现急性荨麻疹患者外周血Th17细胞数量明显高于对照组，结果提示Th17细胞可能与急性荨麻疹密切相关。

Th17细胞是一种效应性、记忆性CD4＋T细胞，约占其总数的17.2%。Th17细胞的确切调控机制仍不十分清楚，可能受IL－23、IL－l2、IL－6、TGF－β、INF－γ等多种细胞因子以及转录因子RORγt的共同作用影响，具有独特的分化和发育途径［12－13］。体内外实验证实IL－6和TGF－β的共同刺激为诱导初始CD4＋T细胞表达IL－17和IL－17F的始动因素；同时IL－6 和TGF－β也是诱导Th17分化的关键细胞因子，单独TGF－β存在条件下初始CD4＋T细胞被诱导分化成具有免疫抑制作用的Treg细胞，而TGF－β与IL－6共同存在时，初始CD4＋T细胞则诱导分化成T17细胞。TGF－β和IL－6的协同作用能诱导RORγt的产生，RORγt是Th17细胞分化的关键转录因子［14］，RORγt缺陷小鼠体内Th17细胞数明显降低，而过度表达RORγt可以促进Th17细胞的表达。本研究发现急性荨麻疹患者外周血Th17细胞诱导因子TGF－β、IL－6和转录因子RORγt m RNA水平均明显高于对照组；结果提示高水平的Th17细胞诱导因子TGF－β、IL－6和转录因子RORγt mRNA诱导了急性荨麻疹患者外周血Th17细胞的分化和成熟。

Th17细胞能够产生多种效应分子，最主要的效应分子是IL－17A和IL－17F［8］。IL－17A即通常所说的IL－17。IL－17生物学效应广泛，其最主要功能是作为炎症介质刺激IL－6、氧化亚氮和前列腺素E2的产生，同时IL－17可通过上调IL－1β、TNF－α、INF－γ等炎症细胞因子基因的表达，促进局部炎症进展和扩大化。IL－17F是Th17细胞分泌的另一效应分子，和IL－17A有许多的相似性，IL－17F可能和IL－17A共享相同的受体，因而发挥与IL－17A相同的生物学效应，参与疾病的进程。研究发现慢性乙型肝炎患者肝组织中Th17细胞相关因子过表达，并且与肝脏炎症和纤维化程度相关［15］。本研究发现急性荨麻疹患者外周血Th17细胞效应因子IL－17A和IL－17F水平均明显高于对照组；结果提示Th17细胞可通过分泌IL－17A 和IL－17F等效应分子参与急性荨麻疹患者的炎症反应。

综上所述，外周血Th17细胞数量增高和炎症因子分泌功能亢进与急性荨麻疹患者的免疫发病机制密切相关。

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Changes in number and function of peripheral blood Th17 cells in acute urticaria patients

Shi Jiaoqi，Zhang Jihua
（Department of Clinical Laboratory，Yangxin People′s Hospital，Yangxin，Hubei 435200，China）

ObjectiveTo study the changes in number and function of peripheral blood T helper cell 17（Th17）in acute urticaria patients.MethodsThe percentages of Th17 in peripheral blood from 50 acute urticaria patients and 50 healthy persons were analyzed by immunofluorescence staining and bicolor flow cytometry（FCM）in vitro.Retinoic acid－related orphan nuclear receptorγt （RORγt）m RNA from the same research objects were detected by quantitative realtime PCR（qPCR）method.Peripheral blood transforming growth factor－β（TGF－β），interleukin（IL）－6，IL－17A and IL－17F were tested by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）from the same research objects.ResultsThe quantity of percentages of Th17（t＝36.634 1，P＜0.05）and levels of RORγt m RNA（t＝23.840 1，P＜0.05）in urticaria patients were higher than those in healthy persons obviously.Meanwhile，the levels of TGF－β（t＝15.521 1，P＜0.05），IL－6（t＝7.247 3，P＜0.05），IL－17A（t＝15.415 3，P＜0.05）and IL－17F（t＝13.032 1，P＜0.05）in urticaria patients were higher than those in healthy persons significantly.ConclusionDysfunction of Th17 in peripheral blood may involve in the immunopathogenesis of acute urticaria.

acute urticaria； T helper cell 17； retinoic acid－related orphan nuclear receptorγt； interleukin

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.10.043

A

1673－4130（2015）10－1416－03

2015－02－12）

石教启，男，主管检验技师，主要从事临床免疫学与检验的研究。