IL-12和IL-17强直性脊柱炎患者的外周血表达水平及两者之间相关性研究

张 立，王 丽，李建平，杨 晓，王蒙蒙，蔡国旗，徐 彬，徐胜前，刘 萍，潘发明

◇临床医学研究◇

IL-12和IL-17强直性脊柱炎患者的外周血表达水平及两者之间相关性研究

张 立1，王 丽2，李建平1，杨 晓2，王蒙蒙2，蔡国旗2，徐 彬1，徐胜前3，刘 萍1，潘发明2

目的检测强直性脊柱炎（AS）患者白细胞介素-12（IL-12）、白细胞介素-17（IL-17）在外周血的分子水平和mRNA相对表达水平，探讨其在AS发病的作用。方法采用ELISA、RT-qPCR法，分别检测45例AS患者和45例健康对照者血清IL-12、IL-17分子水平及其在外周血单个核细胞中mRNA相对表达水平。结果病例组血清IL-12、IL-17水平显著高于对照组（P＜0.05），病例组IL-12 mRNA、IL-17 mRNA相对表达含量显著高于对照组（P＜0.05）；IL-12血清水平和IL-12 mRNA分别与IL-17血清水平和IL-17 mRNA呈正相关性。结论IL-12和IL-17在AS患者中是相关联的分子，可能在AS发病机制中起重要作用。

白介素12；白介素17；强直性脊柱炎；血清水平；mRNA水平

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，其特点是类风湿因子阴性，炎症累及脊椎等中轴关节和肌腱韧带、骨附着点。AS的发病率在白种人中约为1‰～3‰，黄种人中约为3‰，该病发病高峰为20～30岁，多为青壮年，发病隐匿、进展缓慢，严重可致患者丧失劳动能力［1］。AS病因及发病机制目前尚不明确，其可能与遗传、慢性感染、自身免疫功能紊乱和内分泌失调等因素有关。机体的免疫功能异常在该病发病中发挥着重要作用，其中T细胞的免疫功能异常在该病发病中的作用得到了广泛的重视［2］。白细胞介素12（interleukin-12，IL-12）是一种具有多种重要生物学活性的促炎症性细胞因子，参与机体免疫调节，功能性连接天然免疫和获得性免疫，在肿瘤免疫、感染免疫及自身免疫中都发挥着重要的作用。课题组前期研究［3］显示AS患者IL-17与IL-23的含量显著高于健康对照者。而IL-12是与IL-23相关的一个细胞因子，其可能与辅助性T细胞17（Th17）细胞的分化与增殖有一定的关系［4］。研究［5］显示，IL-12可能作用于IL-23R+CD4+T细胞，通过刺激这些细胞，使其分泌大量的IL-17，从而作用于自身免疫性疾病的发生发展。此外，IL-12B基因的一个单核苷酸多态性位点（rs6556416）的突变会导致血清中IL-12的升高，通过一系列的刺激，使得血清IL-17分泌的升高，增强炎症反应［6］。为探讨AS患者IL-12与IL-17的表达及两者之间的关联，该研究检测AS患者和健康对照者血清中IL-12和IL-17的含量，进一步检测外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中IL-12和IL-17 mRNA水平，并分析两者之间的相关性，同时结合临床特征进行相关分析。

1 材料与方法

1.1 病例资料选取2014年4月～9月于安徽医科大学第一附属医院风湿免疫科门诊治疗的AS患者45例作为病例组。所有的AS患者由两名具有副主任以上职称的风湿科医师进行确诊，按1984年美国风湿病学会修订的纽约标准。病例组还需满足：未合并其他慢性炎症性疾病；近期无急性感染；无肿瘤史；不处于妊娠期或哺乳期。对照组按照年龄、性别进行匹配，在合肥市血液中心收集45例健康志愿者。其选择标准为：未患重大疾病及没有疾病家族史；自身无慢性疾病史；直系亲属没有自身免疫性疾病家族史；最近1个月内未诊断患任何疾病，身体健康。根据强直性脊柱炎疾病活动指数（bath ankylosing spondylitis disease activity index，BASDAI）评分来划分AS病情活动组和稳定组，得分范围为0～10分，得分越高表明疾病越严重。将AS患者的BASDAI评分≥4分划分为病情活动组，BASDAI评分＜4分划分为病情稳定组。所有受试者签署知情同意书，并报伦理委员会批准。

1.2 样本的准备受试对象抽取外周血液5 ml，2 000 r／min离心10 min，取血清储存于-80℃备用。剩余标本使用人淋巴细胞分离液分离出PBMCs，加入1 ml的TRIzol试剂，-80℃冰箱保存备用。使用TRIzol氯仿法提取总RNA，使用Nano-Drop2000微量紫外分光光度计测量总RNA浓度及纯度，测量光密度（optical density，OD）值，选择OD260／OD280在1.7～2.0之间的样本使用。使用广州复能基因逆转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA，按照使用说明书配制成25 μl反应体系，置于普通PCR机进行反应，逆转录后的cDNA，置于-20℃保存，用于RT-qPCR法检测。

1.3 RT-qPCR和ELISA法检测运用SYBR® Green法，按照All-in-OneTMmRNA qRT-PCR Detection Kit说明书配制20 μl反应体系，反应使用vii7高通量PCR仪进行，反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃、20 s，72℃退火20 s，共42个循环；融解条件：65℃、1 min，95℃、15 s，每个标本均做3个复孔。IL-12和IL-17 mRNA的相对表达量用2-ΔΔCT值表示。采用IL-12和IL-17双抗体夹心法ELISA反应试剂盒（上海源叶生物科技有限公司）；操作过程均按ELISA试剂盒说明书进行，细胞因子的浓度以ng／L表示。

1.4 统计学处理采用SPSS 19.0软件进行分析。IL-12和IL-17的血清水平及其mRNA相对表达水平以中位数（下四分位数，上四分位数）即M（I，Q）表示，病例组与对照组差异比较使用Mann-Whitney U检验，AS患者血清水平和mRNA水平的IL-12和IL-17之间相关性及其与临床特征的相关性采用Sperman等级相关分析。

2 结果

2.1 研究对象的一般特征病例组年龄为（27.98 ±7.84）岁，对照组年龄为（26.09±7.30）岁，病例组与对照组年龄差异无统计学意义（t＝1.18，P＝0.24）。病例组男／女为15／30，对照组为16／29，病例组与对照组性别比差异无统计学意义（χ2＝0.05，P＝0.82）。在45例AS患者中，93%的患者HLAB27阳性，C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）为7.65（2.38，22.00）mg／L，血沉（erythrocyte sedimentation rate，ESR）为14.00（7.00，24.00）mm／h， BASDAI评分为1.73（0.60，2.95）分。45例患者中有2例患者未接受过治疗。

2.2 RT-qPCR法检测RT-qPCR反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，实验中每个样本做了3个复孔，反应Ct值落在20～32之间，可以判定此次定量较为准确。反应的溶解曲线均为单峰，表明反应特异性好，无非特异性扩增产物产生，无引物高级结构，定量结果有效。见图1、2。

表1 IL-12和IL-17血清水平（ng／L）及mRNA相对表达量在各组间的比较［M（I，Q）］

2.3 血清IL-12和IL-17表达水平和PBMCs中IL-12 mRNA和IL-17 mRNA的相对表达及比较血清IL-12水平病例组表达高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；血清IL-17水平病例组表达亦高于对照组（P＝0.04）；PBMCs中IL-12 mRNA相对表达水平为病例组高于对照组（P＜0.01）；PBMCs中IL-17 mRNA相对水平病例组表达亦高于对照组（P＜0.01）。AS患者活动组与稳定组比较，IL-12和IL-17血清表达水平和mRNA相对水平在两组间差异均无统计学意义。AS患者中轴型与外周型比较，血清IL-12水平外周型表达高于中轴型（P＝0.02）；血清IL-17水平外周型表达亦高于中轴型（P＜0.01），IL-12 mRNA和IL-17 mRNA相对表达水平在中轴型AS与外周型AS间差异均无统计学意义。见表1。

2.4 相关性分析 AS患者血清IL-12与IL-17水平和PBMCs中IL-12 mRNA与IL-17 mRNA相对水平相关性分析结果见图3。AS患者血清IL-12水平与IL-17水平呈正相关性（rs＝0.57，P＜0.01）；IL-12 mRNA相对表达与IL-17 mRNA相对表达水平也呈正相关性（rs＝0.35，P＝0.03）。AS患者IL-12和IL-17血清水平和mRNA相对表达水平与AS临床特点相关性分析结果见表2。AS患者的IL-12和IL-17血清水平或者mRNA相对表达水平与BASDAI、强直性脊柱炎功能指数（bath ankylosing spondylitis functional index，BASFI）、病程、ESR、CRP之间均无相关性。

表2 AS患者IL-12与IL-17血清水平和mRNA相对水平与AS临床特点相关性分析（r）

3 讨论

多种促炎细胞因子和趋化因子在自身免疫性疾病的发病中起重要作用，AS作为一种常见的自身免疫性疾病，这些细胞因子在其发病中的作用值得探讨。IL-12与IL-17都是参与多种炎症反应的促炎细胞因子。IL-12被认为是调节Th1细胞分化的主要细胞因子，可以诱导T细胞向Th1细胞分化，抑制Th2细胞的分化，并促进Th1分泌如干扰素α、肿瘤坏死因子β及IL-2等细胞因子［7］。课题组先前对AS患者血清Th1、Th2相关细胞因子表达水平进行过研究［8］，结果显示Th1与Th2细胞的平衡在AS患者体内存在着失调，并且显示IL-12在维持Th1与Th2细胞平衡中起着重要的作用。此外，IL-17对于多种炎性细胞因子表达具有增强作用例如IL-1、IL-6、IL-23等［9］，这表明IL-17在自身免疫性疾病对炎症反应有加剧的作用。

近年来研究［10］显示IL-12与多种自身免疫炎症性疾病的发病有关。在AS研究中比较了60例AS患者和30例健康对照者血清IL-12水平，结果显示病例组血清IL-12水平显著高于对照组，提示血清中IL-12浓度的上调与AS的发病密切相关［11］，本研究结果与之一致。IL-17也是一类促炎性细胞因子，在自身免疫病中也备受关注［12］。本研究显示45例AS患者的血清IL-17水平显著高于45例健康对照者，先前的研究［13］显示在类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者和AS患者的滑膜液中IL-17表达增加，此外在RA和AS患者的外周血中也显示Th17细胞和IL-17的表达增加，并且在RA患者中IL-17的表达与关节肿胀数和CRP浓度有密切相关，这种相关在本研究中并没有发现。本研究结果中外周血IL-12和IL-17的表达水平在AS活动组与稳定组之间差异无统计学意义，并且与BASDAI评分、BASFI评分、ESR、CRP均无相关性，这可能是由于本次研究样本量较小所致，进一步的研究需要扩大样本量来探索细胞因子与AS疾病活动之间的关系。

在相关性研究中，AS患者血清IL-12水平与血清IL-17水平呈显著的正相关性，这与本次研究推论相一致。进一步采用RT-qPCR检测了病例组和对照组PBMCs中IL-12 mRNA和IL-17 mRNA水平的相对表达水平，结果显示IL-12与IL-17在mRNA水平呈显著正相关性。这提示AS患者血清IL-17水平可能随着IL-12水平的增加而增加。IL-12和IL-17在AS中的相关可能是因为IL-12的水平升高，通过刺激IL-23R+CD4+T细胞，使IL-17大量分泌［5-6］，进而导致大量其他细胞炎症因子如IL-1、IL-6、IL-23等的分泌增加［9］，促进炎症反应增强甚至导致AS的发病。

综上所述，本次研究首次同时检测了AS患者IL-12和IL-17血清水平和mRNA水平，结果显示IL-12和IL-17不仅是在血清水平上呈正相关性，并且在mRNA水平上也呈显著正相关性，提示IL-12和IL-17是相关的细胞因子，并且在AS发病机制中起重要作用。但是血清IL-12和IL-17的表达水平在AS活动组与稳定组之间差异无统计学意义，并且与BASDAI评分、BASFI评分、ESR、CRP无相关性。下一步课题组将考虑进一步扩大样本量来深入研究IL-12与IL-17与AS疾病活动之间的关系，为AS的早期诊断提供科学依据。

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The expression level of peripheral blood IL-12 and IL-17 and their correlation in patients with ankylosing spondylitis

Zhang Li1，Wang Li2，Li Jianping1，et al
（1Anhui Medical Genetics Center in Anhui Medical College，Hefei 230061；2Dept of Epidemiology and Biostatistics，School of Public Health，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo detect serum IL-12，IL-17 levels and their mRNA levels in AS patients and to explore the role of them in the pathogenesis of AS.MethodsELISA and RT-qPCR were performed to measure the levels of IL-12 and IL-17 in the serum and the mRNA in PBMCs，respectively，of 45 AS patients and 45 healthy controls.ResultsCompared with the controls，AS patients’serum IL-12，IL-17 levels were significantly elevated（P＜0.05）；as the same，AS patient’IL-12 mRNA，IL-17 mRNA levels were significantly elevated compared with the controls（P＜0.05）.Moreover，serum IL-12 level and IL-12 mRNA level both were positive correlated with serum IL-17 level and IL-17 mRNA level，respectively.ConclusionOurResultsindicate that in AS patient’IL-12 and IL-17 are correlated cytokine，and they may play critical roles in the pathogenesis of AS.

IL-12；IL-17；ankylosing spondylitis；serum levels；mRNA levels

R 593.23

A

1000-1492（2015）12-1776-05

时间：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.032.html

2015-10-10接收

国家自然科学基金（编号：81273169，81573218）；安徽高校省级自然科学研究重点项目（编号：KJ2014A127）

1安徽医学高等专科学校省遗传医学中心，合肥 230061

2安徽医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，合肥 230032

3安徽医科大学第一附属医院风湿免疫科，合肥 230022

张 立，女，副研究员；

潘发明，男，教授，博士生导师，责任作者E-mail：famingpan＠ahmu.edu.cn