抗坏血酸对创伤性脑损伤的保护作用

张 昊，刘佰运，4，茆 翔

抗坏血酸对创伤性脑损伤的保护作用

张 昊1，2，3，刘佰运1，2，3，4，茆 翔2，5

目的探讨抗坏血酸对颅脑创伤后引起的继发性脑损伤的保护作用。方法将实验大鼠随机分为假手术+生理盐水组、假手术+抗坏血酸组、打击+生理盐水组、打击+抗坏血酸组，每组12只。建立中度颅脑损伤模型，颅脑创伤后24 h进行神经功能损伤评分，测定脑含水量及血脑屏障的通透性；采用Western blot法测定颅脑创伤后24 h的损伤侧脑组织中肿瘤坏死因子α（TNF-α）和水通道蛋白4（AQP-4）的表达情况。结果与打击+生理盐水组比较，打击+抗坏血酸组的神经功能损伤程度减轻（P＜0.05），脑水肿程度降低（P＜0.05），血脑屏障的破坏程度明显降低（P＜0.05），TNF-α和AQP-4的含量降低（P＜0.05）。结论抗坏血酸可以减轻打击后脑水肿和血脑屏障的破坏，起到脑保护的作用。

颅脑创伤；抗坏血酸；脑水肿；氧化应激

颅脑创伤是严重威胁人类健康的公害之一［1］。机体遭受外伤性脑损伤后所发生的各种继发性脑损伤是导致迟发性神经元障碍和死亡的主要原因［2］。创伤性脑水肿，血脑屏障的破坏和开放是外伤性脑损伤后发生的常见的继发性脑损伤［3］，在创伤早期即已发生，随着时间的推移进一步加重。最新研究［4］表明，炎性反应在继发性脑损伤中起重要作用，造成血脑屏障的破坏，加重脑水肿的发生和发展。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是引起颅脑创伤后神经元损伤的主要介质之一。探讨如何减轻打击后继发性脑损伤及其可能的机制显得十分重要［5］。抗坏血酸是一种抗氧化剂，能保持巯基酶的活性和谷胱甘肽的还原状态，防止自由基对人体的伤害。研究［6］表明，抗坏血酸可延缓外伤后早期的氧化应激，延缓打击后病情的发展，在临床上补充抗坏血酸已成为减轻继发性脑损伤的重要方法。然而抗坏血酸对颅脑创伤的保护原理及机制为何，之前的试验研究却未有涉及。该实验将使用抗坏血酸对颅脑创伤后的大鼠进行干预，研究颅脑创伤加重的可能机制，并探讨抗坏血酸对颅脑创伤保护作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组成年健康雄性SD大鼠，重（270 ±15）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。实验动物随机分为假手术+生理盐水组、假手术+抗坏血酸组、打击+生理盐水组、打击+抗坏血酸组，每组12只。

1.2 试剂及药品抗坏血酸；10%水合氯醛；BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物公司）；水通道蛋白4抗体（aquaporin-4，AQP-4）（ab9512，英国Abcam公司）；大鼠TNF-α的ELISA试剂盒（BMS622，美国eBioscience公司）。

1.3 方法

1.3.1 动物模型的建立 4组大鼠按400 mg／kg采用10%水合氯醛麻醉，取头皮正中切口，分离骨膜，暴露颅骨。在右侧前囟和人字缝尖中间，开直径为5 mm的骨窗，注意保持硬膜完整。将大鼠固定于立体定位仪上。将撞击锤（直径为4 mm）安置于颅窗内，紧贴硬膜。采用PinPointTM颅脑损伤撞击器，建立中度损伤的可控性皮质打击模型，打击条件：撞击速度2 m／s，撞击深度2.5 mm，接触时间85 ms。术后缝合创口。假手术组大鼠除不进行撞击外，其余手术操作同打击组。术中用恒温手术台维持实验大鼠肛温（37.0±0.5）℃。

1.3.2 给药 生理盐水和抗坏血酸均采用腹腔注射的给药途径。生理盐水注射剂量为5 ml／kg，抗坏血酸注射剂量为200 mg／kg，注射时间均为伤后即刻开始。

1.3.3 神经功能缺损评分 在损伤后24 h对各组大鼠进行神经功能缺损评分，采用18分的神经功能量表从感觉试验、平衡试验、反射试验等方面评价实验大鼠的神经功能缺损程度。分数越高，神经功能缺损程度越重，采用双盲法对各组进行评分。

1.3.4 脑含水量的测定 在损伤后24 h测定大鼠的脑水肿程度［7］。脑水肿通常通过脑含水量进行测定，采用干湿重的方法测量脑含水量。脑含水量（%）＝［（湿重-干重）／湿重］×100%。

1.3.5 血脑屏障通透性的测定 采用伊文氏蓝（evans-blue，EB）测定血脑屏障的通透性，处死前2 h自股静脉注入2%EB溶液（20 mg／kg），平衡后取出脑组织，加甲酰胺溶液3 ml，加盖避光于54℃水浴箱中萃取3 d，在紫外分光光度计下测量提取液的光密度（optical density，OD）值，使用分光光度计（620～680 nm）测得其OD值，计算大鼠脑组织中EB含量。

1.3.6 TNF-α含量的测定 取打击同侧的海马组织，准确称取组织重量，剪碎标本，加入PBS（pH＝7.0～7.4）充分混合，3 660 r／min离心20 min后取上清液。切割标本，称取质量。加入PBS充分混合，混合后的缓冲液中可加入1 μg／L蛋白酶抑制剂。

1.3.7 Western blot法检测 裂解的蛋白置于100℃水浴10 min后，上样于10%SDS-PAGE中进行电泳；后将蛋白转印于硝酸纤维素膜上，将该膜浸于50 g／L奶粉的1×TBST中室温轻摇60 min用于封闭非特异性结合位点，1×TBST洗3次，每次5 min。加入兔抗大鼠AQP-4抗体，4℃孵育过夜，后移去一抗，1×TBST洗3次，每次5 min。加入二抗（辣根过氧化物酶标记的抗羊和抗兔IgG，1∶5 000），室温孵育1 h，ECL光化学法显色并拍片。

1.4 统计学处理采用SPSS 17.0软件进行分析，对于连续变量采用表示；对于分级变量采用百分比（%）表示；对于连续变量，运用Kolmorogov-Smirnov检验方法对数据进行正态性检验，而后进行方差齐性的分析。对于两组正态连续变量，使用t检验进行比较。采用ANOVA方差分析及post-hoc检验或秩和检验对多组计量资料进行比较。

2 结果

2.1 神经功能损伤评分24 h后，假手术+生理盐水组的神经功能损伤评分为（1.0±0.2）分，假手术+抗坏血酸组的神经功能损伤评分为（0.9±0.3）分，打击+生理盐水组的神经功能损伤评分为（10.0±1.8）分，打击+抗坏血酸组的神经功能损伤评分为（7.9± 2.1）分。打击+生理盐水组的神经功能损伤评分明显高于假手术+生理盐水组、假手术+抗坏血酸组和打击+抗坏血酸组（P＜0.05）。假手术+生理盐水组、假手术+抗坏血酸组与打击+抗坏血酸组间差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

2.2 脑含水量24 h后，假手术+生理盐水组的脑含水量为（82.4±0.1）%，假手术+抗坏血酸组的脑含水量为（82.8±0.15）%，打击+生理盐水组的脑含水量为（83.6±0.25）%，打击+抗坏血酸组的脑含水量为（82.9±0.17）%。分别与假手术+生理盐水、假手术+抗坏血酸组比较，打击+生理盐水组和打击+抗坏血酸组脑含水量明显增加（P＜0.05）；但打击+抗坏血酸组脑含水量低于打击+生理盐水组（P＜0.05），见图2。

2.3 血脑屏障通透性打击+生理盐水组和打击+抗坏血酸组的EB含量均高于假手术+生理盐水组和假手术+抗坏血酸组（P＜0.05），而打击+抗坏血酸组的EB含量低于打击+生理盐水组（P＜0.05），见图3。

2.4 TNF-α的含量分别与假手术+生理盐水和假手术+抗坏血酸组比较，打击+生理盐水组和打击+抗坏血酸组TNF-α表达明显增加（P＜0.05）；与打击+生理盐水比较，打击+抗坏血酸组TNF-α表达减少（P＜0.05），见图4。

2.5 AQP-4的含量分别与假手术+生理盐水和假手术+抗坏血酸组比较，打击+生理盐水组和打击+抗坏血酸组AQP-4表达明显增加（P＜0.05）；与打击+生理盐水组比较，打击+抗坏血酸组AQP-4表达减少（P＜0.05），见图5。

3 讨论

颅脑创伤致残率、致死率高，给社会和家庭带来巨大负担，近几年学者们主要集中研究颅脑创伤后的继发性脑损伤，尤其是颅脑创伤后的缺血低氧性损伤［8］。本实验表明，打击+生理盐水组的神经功能损伤评分、脑组织含水量、血脑屏障的通透性、TNF-α和AQP-4的含量明显高于假手术+生理盐水和假手术+抗坏血酸组，而打击+抗坏血酸组在给予抗坏血酸治疗后，各项指标均明显降低；说明抗坏血酸能够抑制颅脑创伤后脑水肿的发展，降低颅内压的进一步升高和神经元的死亡；降低血脑屏障的破坏，减轻脑组织的炎性反应，从而抑制颅脑创伤后继发性脑损伤的进一步发展。

炎性反应被认为在颅脑创伤后继发性脑损伤的发生中起关键作用。TNF-α参与中枢神经系统的免疫应答和炎性反应。研究［9］表明颅脑创伤后，TNF-α在脑内局部的浓度迅速升高，通过活化了脑内的星形胶质细胞和小胶质细胞，继而引起一系列的损伤变化。本实验结果显示，抗坏血酸在创伤性脑损伤引起的继发性脑损伤中可以通过抑制炎症因子TNF-α的表达，从而减轻脑水肿和血脑屏障的破坏。

AQP-4在脑组织中广泛分布于星形胶质细胞终突的末端，在介导水跨胞膜的流动中起着关键作用。研究［10］表明AQP-4表达量的高低，与脑水肿产生及脑组织损伤呈正相关性。星形胶质细胞膜上的AQP-4蛋白增加，可促进足突的水肿，导致血脑屏障结构进一步被破坏，加重继发性脑损伤。本实验结果进一步说明了抗坏血酸可以抑制AQP-4的表达，减少血脑屏障紧密连接的分解及完整性的破坏，降低血脑屏障的开放及减轻脑水肿。

抗坏血酸为显示抗坏血酸生物活性的化合物的通称，是一种在氧化还原代谢反应中起调节作用的抗氧化剂，其烯二醇结构具有电子供体的特征，在与自由基相结合后，首先失电子生成抗坏血酸自由基，紧接着再次失电子，形成稳定的去氢抗坏血酸，从而起到了清除自由基的功效［11］。本实验表明抗坏血酸较好地消除了自由基对神经细胞的损害，减少了细胞毒性脑水肿；降低了血脑屏障的破坏，从而减少了血中大分子物质及水分从脑血管内渗出从而进入脑组织内后累积于脑细胞外间隙造成的血管源性脑水肿，起到了颅脑创伤后的保护作用。本研究结果提示，打击加重的可能机制为：当机体遭受外伤性脑损伤时，处于低氧状态，通过酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化产物，如醛基、酮基、羟基、羧基、氢过氧基以及新的氧自由基。脂质过氧化还通过链式或链式支链反应，放大活性氧的作用，造成各种继发性脑损伤，颅脑创伤后的氧化应激反应在继发性脑损伤中起重要的作用。抗坏血酸作为一种抗氧化剂，通过自身与自由基的结合反应和保护其他抗氧化剂的途径，有效的防止自由基对人体的伤害［12］，起到了抗氧化应激的作用。因此抗坏血酸对减轻颅脑创伤后的继发性脑损伤具有较好的神经功能保护作用。本实验为抗坏血酸进一步应用于临床治疗提供了重要的实验依据，为颅脑创伤的临床治疗提供了新思路，但涉及的具体机制还有待于进一步研究。

［1］ 张 赛，李建国.神经创伤新进展4［M］.天津：南开大学出版社，2012.

［2］ Gerber L M，Ni Q，Hartl R，et al.Impact of falls on early mortality from severe traumatic brain injury［J］.J Trauma Manag Outcomes，2009，3：9.

［3］ McConeghy K W，Hatton J，Hughes L，et al.A review of neuroprotection pharmacology and therapies in patients with acute traumatic brain injury［J］.CNS Drugs，2012，26（7）：613-36.

［4］ 张小年，张 皓.创伤性颅脑损伤国内研究进展［J］.中国康复理论与实践，2008，14（2）：101-3.

［5］ Niki E.Action of ascorbic acid as a scavenger of active and stable oxygen radicals［J］.Am J Clin Nutr，1991，54（6 Suppl）：1119S-24S.

［6］ Tsenter J，Beni-Adani L，Assaf Y，et al.Dynamic changes in the recovery after traumatic brain injury in mice：effect of injury severity on T2-weighted MRI abnormalities，and motor and cognitive functions［J］.J Neurotrauma，2008，25（4）：324-33.

［7］ del Zoppo G J，Mabuchi T.Cerebral microvessel responses to focal ischemia［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2003，23（8）：879-94.

［8］ Kniesel U，Wolburg H.Tight junctions of the blood-brain barrier［J］.Cell Mol Neurobiol，2000，20（1）：57-76.

［9］ Ashman T A，Gordon W A，Cantor J B，et al.Neurobehavioral consequences of traumatic brain injury［J］.Mt Sinai J Med，2006，73（7）：999-1005.

［10］Fujimoto S T，Longhi L，Saatman K E，et al.Motor and cognitive function evaluation following experimental traumatic brain injury［J］.Neurosci Biobehavl Rev，2004，28（4）：365-78.

［11］Pierce D R，Cook C C，Hinson J A，et al.Are oxidative mechanisms primary in ethanol induced Purkinje neuron death of the neonatal rat？［J］.Neurosci Lett，2006，400（1-2）：130-4.

［12］Yamamoto M，Ramirez S H，Sato S，et al.Phosphorylation of claudin-5 and occludin by rho kinase in brain endothelial cells［J］.Am J Pathol，2008，172（2）：521-33.

The protective effect mechanisms about ascorbic acid on traumatic brain injury in rats

Zhang Hao1，2，3，Liu Baiyun1，2，3，4，Mao Xiang2，5（1General Hospital of Armed Police Forces Clinical College of Anhui Medical University，Beijing 100039；2Neurotrauma Laboratory，Beijing Neurosurgical Institute，Capital Medical University，China National Clinical Research Center for Neurological Diseases，Nerve Injury and Repair Center of Beijing Institute for Brain Disorders，Beijing Key Laboratory of Central Nervous System Injury，Beijing 100050；3Dept of Neurotrauma，General Hospital of Armed Police Forces，Beijing 100039；4Dept of Neurosurgery，Beijing Tian Tan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050；5Dept of Neurosurgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the protective effect of ascorbic acid on secondary brain injury caused by trau-matic brain injury and its possible mechanism.MethodsThe rats were randomly divided into sham+saline group，sham+ascorbic acid group，hit+saline group and hit+ascorbic acid groups.Moderate traumatic brain injury model was established，24 hours after traumatic brain injury，the neurological injury score，brain water content and permeability of blood brain barrier were evaluated.24 hours after traumatic brain injury，the expression of tumor necrosis factor-α（TNF-α）and aquaporin 4（AQP-4）in damaged brain tissue were evaluated by Western blot method.ResultsCompared with the hit+saline group，the hit+ascorbic acid group＇s degree of neurologic injury mitigated and brain edema reduced，the extent of damage to blood brain barrier reduced significantly，TNF-α and AQP-4 reduced.ConclusionAscorbic acid can reduce brain edema and fight against the destruction of the blood brain barrier.

traumatic brain injury；ascorbic acid；brain edema；oxidative stress

R 651.15

A

1000-1492（2015）12-1734-05

时间：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.012.html

2015-09-30接收

国家自然科学基金（编号：81471238）

1安徽医科大学武警总医院临床学院，北京 1000392北京市神经外科研究所颅脑创伤室、国家神经系统疾病临床医学研究中心、北京脑重大疾病研究院神经损伤与修复研究所、中枢神经系统损伤研究北京市重点实验室，北京 100050

3中国人民武装警察部队总医院神经创伤科，北京100039

4首都医科大学附属北京天坛医院神经外科，北京100050

5安徽医科大学第一附属医院神经外科，合肥 230022

张 昊，男，硕士研究生；

刘佰运，男，教授，主任医生，硕士生导师，责任作者，E-mail：liubaiyun1212＠163.com