兔源多杀性巴氏杆菌C51－17株omp A基因表达与免疫原性鉴定

徐为中，王 芳，胡 波，范志宇，魏后军，宋艳华，薛家宾，仇汝龙，刘 星

(江苏省农业科学院兽医研究所，农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京210014)

多杀性巴氏杆菌是世界各地引起巨大经济损失的病原体。多杀性巴氏杆菌可以引起牛羊的支气管肺炎，黄牛和水牛的出血性败血症，猪的萎缩性鼻炎，家兔的传染性鼻炎和禽霍乱。人感染多杀性巴氏杆菌主要由于狗猫抓咬后细菌通过伤口感染导致蜂窝织炎和淋巴管炎，有时形成复杂脓肿和化脓性关节炎，在免疫功能低下时多杀性巴氏杆菌甚至可以引起全身系统性感染如脑膜炎和心内膜炎［1］。

外膜蛋白仅存在革兰氏阴性菌细胞膜中，是组成细胞膜的主要成分，在维持细胞形态和物质运输过程中起着重要作用，多杀性巴氏杆菌外膜蛋白被认为是重要的免疫原，对多杀性巴氏杆菌病的发病机理和免疫保护有重要作用［2］。ompA是多杀性巴氏杆菌主要外膜蛋白之一，ompA在多杀性巴氏杆菌感染过程中对宿主细胞的粘附、侵袭，血清抗体的产生，免疫逃避和免疫靶向起重要作用［3-4］。多杀性巴氏杆菌ompA是暴露在细胞膜表面，能在体内表达，具有良好免疫原性和抗原性的保守蛋白［5］。牛免疫接种多杀性巴氏杆菌外膜蛋白，能产生高的抗体水平，能抵抗攻毒试验，其中ompA是牛产生抗体的主要蛋白［6］。笔者扩增出兔源多杀性巴氏杆菌C51-17ompA基因，在大肠杆菌BL21中实现了高效表达，免疫印迹试验显示，重组蛋白具有较好的免疫原性，以期为以后兔多杀性巴氏杆菌的诊断和疫苗的研制提供优质的蛋白抗原。

1 材料与方法

1．1 菌株和质粒 兔源多杀性巴氏杆苗C51-17菌株，由江苏省农业科学院兽医研究所鉴定保存;质粒pGEX-6p-1、大肠杆菌BL21、大肠杆菌DH5α购自大连宝生物(TaKaRa)有限公司。

1．2 试剂 DNA Marker DL2000、DNA Marker DL15000、dNTPs、高保真Pfx DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶和DNA凝胶回收试剂盒购自大连宝生物(TaKaRa)有限公司，HRP标记羊抗鼠IgG购自生兴生物有限公司;DAB显色试剂盒购自碧云天生物技术公司，NC膜、IPTG购自基天生物有限公司。

1．3 omp A基因的扩增 根据GenBank公布的多杀性巴氏杆菌ompA序列AE004439，应用PrimerPremier软件设计2对扩增多杀性巴氏杆菌C51-17ompA基因的引物:PmAF:5′-TACCTTTAACAGCG-3′(Xho I)。引物由上海英潍捷基生物有限公司合成，引物PmAF、PmAR扩增多杀性巴氏杆菌ompA全基因;引物PmADF、PmADR分别加入酶切位点Bam H I、Xho I扩增多杀性巴氏杆菌ompA去信号肽基因。

1．4 多杀性巴氏杆基因组DNA的提取 将多杀性巴氏杆菌C51-17接种于马丁肉汤中，37℃振荡培养过夜，所得的菌液用于提取模板DNA，DNA的提取按照柱式细菌DNAout试剂盒说明书进行。

1．5 PCR扩增 PCR反应体系:模板DNA 4．0 ul，Pfx DNA聚合酶0．4 ul，10 × Taq Buffer 2．5 ul，上游、下游引物(20 umol/L)各 1．0 ul，dNTPs(2．5 mmol/L)2．0 ul，MgCl2(25 mmol/L)2．5 ul，H2O 11．6 ul。

PCR反应条件:94℃预变性3 min;94℃变性35 s，54℃退火30 s，68℃延伸60 s，35个循环;68℃延伸10 min，产物4℃保存。

PCR产物凝胶电泳鉴定:PCR产物经1．2%的琼脂糖凝胶电泳，回收纯化目的片段后送至上海英潍捷基公司测序。

1．6 重组表达载体的构建及鉴定 用Bam H I、Xho I双酶切pGEX-6p-1质粒，胶回收试剂盒回收酶切后的载体，同时用Bam H I、Xho I双酶切去信号肽ompA基因扩增产物，胶回收试剂盒回收含去信号肽ompA基因片段，用T4连接酶连接双酶切后的pGEX-6p-1质粒和去信号ompA基因片段，连接产物转化大肠杆菌 BL21，挑取阳性克隆，提取质粒，用Bam H I、Xho I双酶切鉴定，正确的重组质粒pGEX-dompA送至上海英潍捷基公司测序。

1．7 大肠杆菌BL21表达ompA基因及蛋白SDS-PAGE分析 将重组质粒pGEX-dompA转化感受态大肠杆菌BL21细菌，挑取单个菌落，37℃培养至对数生长期，加入IPTG至终浓度为0．2 mmol/L，诱导表达4 h，同时设含空白载体(pGEX-6p-1)大肠杆菌对照。表达产物用10%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳。

1．8 Western blot分析 诱导表达的融合蛋白经10%聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳分离后，电转印转移到NC膜上。转移后的NC膜在5%的脱脂乳中4℃封闭过夜，先用PBST洗涤2次后，PBS再洗涤1次，每次10 min;洗完后加入1∶200倍稀释的兔抗Pm阳性血清37℃孵育1 h后，弃去一抗，先用PBST洗涤2次，PBS再洗涤1次，再以HRP标记羊抗兔IgG为二抗，37℃孵育1 h，弃去二抗，先用PBST洗涤2次，PBS再洗涤1次，DAB显色15 min，用水洗涤反应终止。

2 结果与分析

2．1 ompA基因的扩增和克隆 利用引物PmAF、PmAR进行PCR扩增，成功扩增了ompA基因。扩增片段大小为1 062 bp;引物PmADF，PmADR扩增ompA去信号肽基因，扩增片段大小为999 bp，编码332个氨基酸(图1)。测序结果正确。

2．2 重组载体pGEX-dompA双酶切鉴定 将引物PmADF、PmADR扩增的ompA去信号肽基因插入到pGEX-6p-1载体，构建成功的重组载体pGEX-dompA，用Bam H I，Xho I双酶切重组载体pGEX-dompA，酶切产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离得到去信号肽ompA基因999 bp、pGEX-6p-1载体4 900 bp，鉴定结果见图2，将酶切鉴定符合的重组载体pGEX-dompA送上海英潍捷基公司测序，测序结果与PmADF、PmADR扩增ompA去信号肽基因完全一致。

2．3 大肠杆菌导入BL21诱导表达ompA蛋白SDS-PAGE和Western blot分析 将重组载体pGEX-dompA导入BL21大肠杆菌后，挑取单菌落接种至AMPrLB培养基，37℃培养至对数生长期，加入IPTG至终浓度为0．2 mmol/L，诱导表达4 h后，经10%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳，结果出现63 ku的蛋白条带，与预期大小一致。Western blot分析结果显示，表达的重组蛋白与兔抗多杀性巴氏杆菌阳性血清在63 ku处出现免疫反应，而与兔抗多杀性巴氏杆菌阴性血清没有反应(图3)。

3 结论与讨论

该研究对兔源多杀性巴氏杆菌C51-17外膜蛋白ompA基因进行了扩增，开放阅读框包含1 062 bp碱基，翻译成蛋白包含353个氨基酸，分子量38 ku，用Signal PV2．0预测信号肽的裂解位点位于第21～22个氨基酸之间，在NCBI中Blast序列比对结果显示，与Pm70菌株核苷酸的同源性达96%，氨基酸的同源性达98%。在构建重组表达载体pGEX-dompA时去掉前面63个编码信号肽核苷酸，避免大肠杆菌表达多杀性巴氏杆菌ompA时，重组蛋白融合到宿主菌的细胞膜中，干扰宿主细菌细胞膜的功能，影响重组蛋白的表达，去掉信号肽的重组多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompA得到高效表达，表达产物经免疫印迹试验证明具有较好的免疫原性。

ompA蛋白具有较好的抗原性，能够诱导机体产生细胞免疫和体液免疫，重组的多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompA免疫小鼠后，能刺激机体产生强烈的Th2型免疫反应，产生高IgG1抗体［7］，表明体外表达的重组蛋白免疫动物同样刺激机体产生免疫反应，因此该研究表达的重组多杀性巴氏杆菌蛋白ompA可以作为诊断试剂盒和疫苗开发的蛋白使用。

［1］EWERSC，LUBKE-BECKER A，BETHE A，et al．Virulence genotype of Pasteurella multocida strains isolated fromdifferent hosts with various disease status［J］．Vet Microbiol，2006，114:304-317

［2］BASAGOUDANAVAR SH，SINGH D K，VARSHNEY B C，et al．Immunization with outer membrane proteins of Pasteurella multocida(6:B)provides protection in mice［J］．JVet Med A Physiol Pathol Clin Med，2006，53(10):524-530．

［3］DABOSM，CONFERA W，QUIJANO-BLASRA，et al．Molecular and immunological characterization of Pasteurella multocida serotype A:3 OmpA:evidence of its role in P．multocida interaction with extracellular matrix molecules［J］．Microb Pathog，2003，35(4):147-157．

［4］SMITH SG，MAHON V，LAMBERT M A，et al．A molecular Swiss army knife:OmpA structure，function and expression［J］．FEMS Microbiol Lett，2007，273(1):1-11．

［5］CARPENTER T，KHALID S，SANSOM M S，et al．A multidomain outer membrane protein from Pasteurella multocida:Modelling and simulation studies of PmOmpA［J］．Biochim Biophys Acta，2007，1768(11):2831-2840．

［6］PRADOM E，DABO SM，CONFER A W，et al．Immunogenicity of ironregulated outer membrane proteins of Pasteurella multocida A:3 in cattle:Molecular characterization of the immunodominant heme acquisition system receptor(HasR)protein［J］．Vet Microbiol，2005，105(3/4):269-280．

［7］DABOSM，CONFER A，MONTELONGO M，et al．Vaccination with Pasteurella multocida recombinant OmpA induces strong but non-protective and deleterious Th2-type immune response in mice［J］．Vaccine，2008，26:4345-4351．