数字微流控生化芯片多液滴稀释方法的研究＊

张 玲，梅军进

（湖北理工学院计算机学院，湖北 黄石435003）

1 引言

片上试验室LOC（Lab－On－a－Chip）是近年来为进行重大药物研制而出现的一种新的生化试验模式［1～5］。LOC通常在一个只有几平方厘米的小芯片上运行一个或多个生化试验协议或者生化检测，但这个小小的芯片却涉及多个交叉领域，包括微电子、生物化学、病毒诊断、计算机辅助设计、制造等领域，与传统的试验过程比较，LOC 非常节省样品和试剂，并且不容易出人为错误，结果较准确［1，5～7］。

样品试剂的配备过程是生化试验中最常用且必需的基本操作，传统的LOC 无法将样品配备放在片上进行，需要片外准备，给整个LOC试验过程造成延期。而对于DMF（Digital MicroFluidic）的芯片，则可以通过设计片上协议来进行样品配备，通过控制离散的液滴多次混合/分离操作而获得目标样品。样品配备一般通对储备的原溶液进行稀释来获得各种目标浓度溶液［8］。如何通过最少的步骤且产生较少的废弃液滴获得目标溶液是样品配备的一个挑战［9］。

DMF生化芯片通常在一个二维电极阵列上通过控制离散的液滴运动来实现相应的生化试验，因此，相应的控制液滴为单位液滴的整数倍，其中单位液滴（Unit Volume）为电极阵列控制的液滴单位。混合操作可以抽象为（k∶l）的模式，代表k个单位的物质1和l个单位的物质2同时参与混合操作，获得（k＋l）单位的混合物［9］。若用CF来表示结果浓度，稀疏过程可以描述为给定浓度为100%的试剂或样品和给定浓度为0%的中性溶液，确定一系列的（k∶l）模式的混合过程来达到所需要目标浓度。

已有的基于数字微流控芯片的混合方法均是基于两液滴混合/分离模式［9，10］，即（k∶l）＝（1∶1）。二进方法BS（Bit Scanning）［10］提出利用两液滴混合的（1∶1）模式对两种物质进行混合以获得目标浓度，它用二进制数来阐述所产生的中间浓度和目标浓度，从而通过扫描二进制串来实现所有的混合/稀释步骤，它可以在误差允许内获得目标液滴浓度。但是，其每次的混合操作都是以原液滴浓度液滴作为混合液滴之一来获得目标液滴浓度，经过了较多的中间步骤才能获得目标浓度。为了进一步减少混合/分离操作和所产生的废气液滴，文献［9］提出用类似折半查找的混合/分离方法不断向目标液滴浓度靠近的方法，即假设参与混合的两个浓度Cl和Ch液滴混合，得到新的浓度为C1＝（Cl＋Ch）/2，将目标液滴浓度Ct与新获得的液滴浓度C1进行比较，若Ct的浓度小于C1，则下一次参与混合的液滴浓度为Cl和C1，获得新的液滴浓度（Cl＋C1）/2；若Ct的浓度大于C1，则下一次参与混合的液滴浓度为C1和Ch，获得新的液滴浓度（Ch＋C1）/2；继续这个混合过程，Ct的浓度与C1相等或在误差允许范围之内，相应的Ct就是最终的目标浓 度。图1 给 出 了BS［10］和 二 进 搜 索［9］混合/分离的例子，目标浓度为313/1024。如图1a所示，BS 方法［10］每次将新的浓度与原浓度比较，最终获得目标浓度；图1b折半搜索［9］每次用折半查找来逐渐获得目标液滴。虽然BS 方法和二进搜索方法都减少了混合/分离的步骤获得目标液滴，但考虑数字微流控的可配置型，用两液滴混合模式操作经历过多的操作步骤，不仅增加了在线操作时间，而且产生了较多的废弃液滴，浪费了药品。

Figure 1 Conventional two droplets mixing operations for 313/1024图1 传统的两液滴混合模式313/1024

为了实现样品试剂配备过程，减少混合/稀释步骤和相应的稀释时间，并减少中间废弃液滴，本文充分利用数字微流控的可配置性，利用数字微流控多液滴混合器资源进行样品配备，使用较少步骤完成混合/稀释操作，获得目标浓度的液滴。实验结果表明，该多液滴混合方法可以高效地完成混合/稀释操作，获得目标浓度液滴，同时减少中间废弃液滴的数目。

2 多液滴参与稀释混合器操作

数字微流控芯片的最大特点就是其可重用性和可配置性，也就是说可以根据需要将生化操作协议映射到芯片上，并在运行完后运行其它生化试验［9］，因此很容易在片上设置多液滴混合器。假设片上混合器允许n（n＞2）个液滴同时参与混合操作，要获得的目标浓度为Ct，则多液滴混合/分离获取目标浓度问题可以描述为：

输入：给定两种浓度Cl和Ch，目标浓度为Ct，并且0≤Cl＜Ch≤1。

输出：从Cl和Ch开始混合获得目标浓度Ct所需要经历的混合/分离操作M，例如M＝mix＿split（X，Y），而X、Y为某个中间浓度或者两个给定浓度产生的中间浓度的废弃液滴的数目。

多液滴混合/分离操作的算法可以描述如下：在每一次设计混合/分离操作时，先计算当前已有资源可以获得的所有浓度，再依次与目标浓度比较，选取具有较小范围且较接近的浓度所对应的操作为当前的混合/分离操作，并更新相关的参数，以进行下一次的混合/分离设计。具体算法如下：

算法1 多液滴混合操作算法

如算法所描述，多液滴混合/分离操作允许多个液滴同时参与操作，所以在每一次的混合/分离操作之前，必须先确定当前参与混合的两个浓度Cl和Ch的比例。将Cl和Ch两种浓度一次混合/分离操作可以获得的目标浓度表示为集合tempn＝｛d1，d2，d3，…，dn－1｝，其中d1＝（Ch＋（n－1）Cl）/n，d2＝（2Ch＋（n－2）Cl）/n，d3＝（3Ch＋（n－3）Cl）/n，dn－1＝（（n－1）Ch＋Cl）/n，如步骤（1）所示。将集合元素逐个与目标浓度Ct比较，其最小的差值表示为diffmin，diffmin若不在误差允许范围内，则继续下一个步骤，否则算法结束，这个过程如算法的步骤（2）所示。为了用较少的混合/分离步骤获得目标液滴，对集合tempn进行排序，并与目标浓度Ct进行比较，若Ct处于某两个浓度之间，则分别计算使用这两个浓度的搜索范围（dj－Cl）与（Ch－di）的大小，根据较小范围更新Ch或Cl；而若所有浓度均小于Ct，则更新Cl；否则所有浓度均大于Ct，则更新Ch，更新后转（1），这个过程如步骤（4）所描述。接着继续新的混合/分离过程，直到diffmin在误差允许范围之内，获得目标浓度。

表1给出多液滴混合/分离算法的一个例子，该例子用4液滴混合器对样品进行稀释，初次参与混合/分离的较低浓度和较高浓度分别为Cl＝0/1024，Ch＝512/1024，要获得的目标浓度为Ct＝313/1024，要求误差为0。根据多液滴稀释算法，首先计算Cl和Ch经过一次混合/分离操作可以获得的浓度集合tempn＝｛768/1024；512/1024；256/1024｝，选择dj＝d2对应的操作作为当前操作，即1个液滴的Cl和1个液滴的Ch进行混合/分离，并更新Ch＝512/1024，这个过程对应于表1 的第一行；接着转第一步，进行新一轮的混合/分离操作，更 新tempn＝｛128/1024；256/1024；384/1024｝，计算后选di＝d2作为当前操作，即1个液滴的Cl和1个液滴的Ch混合/分离，经过计算更新Cl＝256/1024，这个过程对应表中第二行；接着同样的步骤，直到误差为0，获得目标液滴。图2给出了该方法获得目标浓度313/1024的操作过程示意图，多液滴混合/分离方法需要的样品液滴个数（浓度为1024/1024的液滴）为2，产生的废弃液滴（没有用到的中间液滴，如图2中的三角形所示）为5个，而所需要的缓存个数（产生后没有被立刻用到，但在后边的步骤要用到的液滴，如图2中的正方形所示）为5，所需要的混合/分离的步骤为7步。

由图2可见，获得同样的浓度，与图1所示的两种方式比较，多液滴稀释方法不仅节省了药品，产生较少的废弃液滴，所需的缓存单元和混合/分离的步骤也有所减小。

该算法利用数学分析准确计算所需要的混合/稀释步骤，再利用数组微流控芯片进行操作，可以准确获得目标液滴。另一方面，假设找到了符合误差的目标浓度为C，则以C浓度为密度将浓度中性溶液到源溶液平均分为m段，则利用n液滴混合法找到该目标浓度的算法复杂度仅为O（logn（m））。

3 实验结果和分析

为了验证本方法的有效性，实验分别用折半搜索［9］和多液滴稀释方法对多个在1/1024到1023/1024之间的目标浓度进行了实验，其中实验用到的是4液滴混合器，实验结果在图3、图4 和表2给出。

Table 1 Mixing operations of the target droplet with Ct＝313/1024表1 Ct＝313/1024利用多液滴混合算法的过程

Figure 2 Illustration of target droplets with 313/1024operations图2 获得313/1024目标浓度用4液滴混合器混合过程示意图

图3和图4分别给出了为获得目标浓度96/1024和127/1024，分别用折半搜索［9］和多液滴稀释方法的操作示意图，其中图3a和图4a为折半搜索方法的示意图，同时给了所需的操作步骤数、所用样品液滴、废弃液滴及所需存储的液滴的个数；而图3b和图4b给出本文提出的多液滴稀释方法的示意图，其中三角形和方框分别代表对应位置产生废弃液滴和需要存储缓冲液滴。从图3 和图4中可以明显看出，多液滴混合稀释方法不仅减少了操作步骤，而且减少了废弃液滴，同时获得了较多的目标液滴。

表2给出了其他多个在1/1024到1023/1024之间的目标浓度的实验结果比较，其中＃d/m、＃sd、＃wd、＃bud和＃td分别代表所需要的混合/分离步骤、需要的样品液滴个数、产生废弃液滴的个数、所需要存储的缓存液滴个数、获得的目标液滴个数。为了更好地比较两种方法的效率，表2中还给出了所用的样品液滴和获得的目标液滴的比率ratio，其中ratio＝＃sd/＃td，代表＃sd个样品液滴经过多个混合/分离步骤获得＃td个目标浓度的液滴。从结果可以看出，多液滴混合/分离的稀释方法不仅使用较少的步骤获得目标液滴、产生了较少废弃液滴，而且具有较高的效率。

Table 2 Comparison of target droplets achievement表2 获取目标液滴操作情况的比较

Figure 3 Illustration of target droplets with 96/1024operations图3 获得目标浓度96/1024操作过程比较示意图

4 结束语

本文针对数字微流控生物芯片提出样品试剂配备的优化过程，利用多液滴片上混合器进行目的浓度的液滴配备。该方法先计算当前资源可以获得的浓度集合，再根据此浓度集合与目标浓度的关系分三种情况进行操作选择和下一次的操作数据更新，直到获得误差允许下的目标浓度。实验结果表明，本方法不仅可以在误差允许范围内高效地进行目标浓度的配置，而且减少了需要的操作步骤和废弃液滴，减少了样品配置时间。

Figure 4 Illustration of the target droplets with 127/1024operations图4 获得目标浓度127/1024操作过程比较示意图

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附中文参考文献：

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