产石杉碱甲新资源研究方法探索

韩文霞，宋 涛，李伟泽，张 寒，邵明明，武永红

(1.西安医学院医学技术系，陕西 西安 710021；2.空军工程大学校务部门诊部，陕西 西安 710051)

产石杉碱甲新资源研究方法探索

韩文霞1，宋 涛2，李伟泽1，张 寒1，邵明明1，武永红1

(1.西安医学院医学技术系，陕西 西安 710021；2.空军工程大学校务部门诊部，陕西 西安 710051)

从老年痴呆症药物需求研究到药物生产开发全方位视角对近期治疗老年痴呆症一线药物-石杉碱甲来源及生产的发展与动态进行综述，并对今后产石杉碱甲菌株研发方法进行了展望。源于天然植物的药物开发历史悠久且富有生命力，植物提取获得石杉碱甲为最简便方式，但植物提取获得石杉碱甲已面临植物资源匮乏瓶颈；化学合成生产石杉碱甲仍是研发重要途径之一，但合成步骤繁琐、代价昂贵，很难获得纯光学活性的合成物；利用从野生蛇足石杉内分离获得的内生真菌及其发酵液中提取石杉碱甲正在取得成效；依托生物技术改造菌株获得石杉碱甲将会是工业化生产开发的一个重要方向。

老年痴呆症；石杉碱甲；蛇足石杉；内生真菌；菌株改造

伴随世界人口结构老龄化进一步加剧，阿尔茨海默病防治已变为全球关注焦点。阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)又名老年痴呆症。目前发展中国家AD患者人数占全球AD患者总人数的56%，预计到2050年将增至71%左右。在AD药物市场上目前乙酰胆碱酯酶抑制剂类药物处于主导地位，主要治疗药物有加兰他敏、多奈哌齐、卡巴拉汀、他克林、美金刚、石杉碱甲。石杉碱甲为从草药蛇足石杉中提取获得的有效成分，是治疗AD的一线药物，但目前国内外面临重大技术难题是植物提取面临生产周期长，资源匮乏、提取含量及其低微而难以满足临床需求的困难；化学合成面临成本高、副产物多、纯化困难、污染环境等而难以大规模应用困难。因此，寻求更有效的生物合成获得途径生产石杉碱甲将成为今后药物研究的热点。本文对老年痴呆症发展趋势、发病机理、治疗药物、药物来源与生产途径做了全面综述，以期为进一步生物合成生产石杉碱甲提供参考。

1 老年痴呆症

1.1 老年痴呆症发展趋势 据中国阿尔茨海默病协会2011年发布的最新调查结果显示，全球约有3650万人患有AD，每7 s中就会有一个人患上该疾病，患者的平均生存期一般只有5.9年，已逐步成为威胁老年人健康的主要疾病之一。1998年我国60岁以上人口达到1.2亿，并已呈现出老龄化进一步加快趋势，每年以3.2%左右速度递增，本世纪中叶可达4亿左右，我国将成为世界上老龄人口最多的国家，由此导致老年痴呆症(Alzheimer's disease，AD)患者急剧增多，由此表明AD药物市场将是一个容量巨大、前景广阔的药物市场。

1.2 老年痴呆症发病机理 AD是一种以进行性痴呆为主要特征的神经元退变性疾病，主要表现为进行性认知功能衰退、记忆力衰退、性格及行为改变等。乙酰胆碱(Acetyl choline，Ach)是中枢胆碱能神经系统重要的神经递质，它由胆碱乙酰基转移酶(Choline acetylase，ChAT)合成、乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AchE)分解，通过Ach受体直接参与植物神经功能调节、肌肉运动、大脑思维与记忆功能等；ChAT和AchE活性发生变化，随后导致Ach代谢失调，最终使中枢胆碱能神经系统的生化特征改变，此为诱发AD发病的重要原因之一。

1.3 治疗老年痴呆症临床一线药物 目前乙酰胆碱酯酶抑制剂类药物在AD药物市场上处于主导地位。石杉碱甲(Huperzine A，HA)为从民间草药蛇足石杉中分离获得的新型石松类单体生物碱，具有多靶点作用，不仅能够阻断AchE对Ach的降解而增加脑内Ach的浓度以提高学习和记忆功能；还可以由多因素诱导的氧化应激和细胞凋亡等神经元毒性作用得到抑制[1-2]，使实验性记忆损害得到显著性改善。HA是一种强效的可逆性的胆碱酯酶抑制剂，对AchE的抑制作用为毒扁豆碱的3倍、加兰他敏的30倍[3]，而且外周不良反应低。因此，HA将成为AD药物市场上的新秀，具有广泛的临床应用价值。

2 石杉碱甲

2.1 石杉碱甲的天然来源 近年来，石杉碱甲主要来源为从天然蛇足石杉的植株中提纯获得。目前由天然植株可以获得HA的植物主要有：蛇足石杉、马尾杉、藤石松、小接筋草。野生条件下，从孢子落地萌发到地下配子体的生成乃至形成成熟的孢子体，这个过程至少需要15年时间而且产孢量极其低，又难以收集。而由成熟的孢子长成一株高12 cm左右的幼苗，至少需要6年以上的时间。因此依靠天然提取获得石杉碱甲的资源相当有限，且石杉碱甲在蛇足石杉全草中含量甚微，石杉碱甲的获得难以满足临床需求。也有学者尝试通过植物组织培养及植株培育方面进行研究[4-7]。但所获得植株生长速度依然较缓慢，大面积的农业推广和药物利用依然较难以推进。因此，仅靠天然提取法获得HA还远远满足不了市场和临床用药的需求。

2.2 石杉碱甲化学来源 近些年国外在分离产HA菌株方面研究较少[8-12]，国外主要集中在利用化学方法合成HA。由于石杉碱甲的特殊疗效及临床药物的大量需求，国内外研究学者对HA衍生物、其类似物的合成及全合成做了众多的研究，但其合成步骤繁琐、代价较高，且存在环境污染及难以获得纯光学活性合成物，至今仍无法进行工业化生产[13-17]。因此利用生物手段寻找石杉碱甲来源成为关注的热点。

2.3 石杉碱甲微生物来源 HA作为一种非常有潜力的治疗AD一线临床药物，科研学者正致力于对其进行深入研究。鉴于植物提取和化学合成法生产HA都面临困难，难以满足临床需求，因此研究石杉碱甲的新的获得途径更加迫切。基于内生真菌与其共生的宿主可以交换遗传物质这一理论，从野生蛇足石杉中可以分离纯化内生真菌获得产石杉碱甲菌株。在内生真菌分离方面，目前国内主要是从我国蛇足石杉(千层塔)中分离出芽胞菌属(Blastomyces Cost. ex Roll)、支顶孢属(Acremonium)、葡萄孢属(Botrytis Pets.ex Fr)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、镰刀菌(Fusarium sp.)、炭角菌(Xycarialern species)、枝孢芽枝属(Cladosporium cladosporioides)、纤姿拟青霉(Paecilonmyces tennis)、炭角菌目(Xylariales)、胶胞炭疽菌(C.gheosporioideES026)、产黄青霉属(Penicillium chrysogenum)、柄孢壳菌属(Podospora)内生真菌菌株[18-24]。已分离获得的内生真菌代谢产物中能够提取出与宿主植物相同的活性成分HA，但野生菌发酵次生代谢产物中所含石杉碱甲量甚微，离工业化生产石杉碱甲还有很大距离。

3 微生物来源石杉碱甲菌株改造研究方向

随着植物资源开发利用及面临资源匮乏难题，如能采用生物合成途径利用高产HA内生真菌发酵生产石杉碱甲，不仅能有效地解决临床一线用药需求，拓宽石杉碱甲的药物来源、降低成品药品的价格，而且可有效地保护生态环境。因此如何采用生物学方法制备HA成为当今最受人关注的研究课题。

3.1 原生质体融合技术 随着食用菌育种需求的发展，原生质体技术应用越来越广泛。迄今，国内外学者利用原生质体技术对食用菌育种进行了大量的研究[25-28]，已成功从50多种食用菌中制备获得原生质体，并对获得的菌种进行了大量研究。目前在真菌育种基础研究如微生物遗传育种、酶的定位、细胞壁的合成和基因定位工作中应用广泛。当今国内外应用原生质体进行诱变育种的技术也趋于成熟化，常用的技术包括：原生质体的制备与再生、原生质体融合、原生质体诱变、转化及固定化等技术[29-30]。该技术在研究微生物细胞遗传特性的改造中起着重要作用，与菌体细胞相比，原生质体的成功制备使细胞缺乏细胞壁的保护，因此在各种诱变因素作用下更易发生基因变异。而在其诱变筛选技术中，诱变选育效率与原生质体的制备与再生条件的成功获得息息相关。且原生质体的获得也为下一步原生质体的融合奠定基础。原生质体作为一种简单高效的菌种改造实验材料，已经在微生物学育种中得到广泛应用。近年来，随着工业和医药迅速发展，为获得更好的经济效益，真菌原生质体的研究对象逐渐转向具有工业和临床价值的生产菌株[31-35]。

3.2 微生物转化法 微生物转化方法就是利用微生物细胞代谢过程中产生的一种或多种酶类对复杂底物进行结构改造或修饰。目前微生物转化方法主要包括：固定化细胞转化法，固定化酶转化法，连续转化法，分批转化法，孢子转化法，静息细胞转化法和干细胞转化法。微生物转化是利用单一微生物的单酶或多酶进行的高密度转化，本质为酶催化转化，而直接发酵法是利用多种微生物的酶进行的低密度转化。因此，微生物转化具有产物浓度高、副产物少、转化率高、工艺及后处理简单的优点。微生物转化与化学合成方法相比同样具有很多优势，如可有效减少副反应及合成步骤、操作条件简单温和、提高产率同时大大缩减生产周期等。高度的选择性为微生物转化的最大优势，利用微生物转化方法可对于某些难以进行或反应复杂的有机化学反应专一、高效地完成[36]。近些年，利用微生物转化法进行研究逐渐成为研究热点[37-44]。探索研究采用微生物转化法，通过利用微生物酶系的修饰作用将底物转化成HA，将会为HA合成开辟一条新的获得途径。

3.3 遗传转化研究 自20世纪90年代以来，真菌遗传转化已经取得显著进展。近年来，随着真菌在分子生物学水平上的研究及进展，真菌的全基因组序列测序越来越多，约有上百种真菌成功实现了遗传转化。依托大规模随机和定点突变技术的应用，改变真菌的遗传物质，真菌生物学的研究进入了功能基因组学时代。遗传转化的研究为深入探明真菌的一些代谢及生理机制提供了有效方法。当前实现真菌的遗传转化主要方法：通过原生质体融合进行遗传转化(不借助载体)、聚乙二醇介导转化法(Polyethlene glycol，PEG)、电击转化法(Eiectroporation)、电注射法(Electric injection)、基因枪法(Gene gun bombardment)、限制性内切酶介导转化法(Restriction Ellzyme Mediated DNA Integrafi,REMI)、农杆菌介导转化法(Agrobacterium tumefaciens—mediatedtransformation，ATMT)，其中农杆菌介导遗传转化是目前应用最为广泛的方法。1995年Bundock等[45]首次对酿酒酵母应用农杆菌质粒实现了遗传转化。1998年De Groot等[46]构建了农杆菌介导的丝状真菌转化体系，并证明菌组织、原生质体、孢子、菌丝都可作为农杆菌介导转化的初始材料。自此之后利用农杆菌转化方法转化的真菌已达100多种[47]，并有多种真菌利用该方法构建了含丰富类型转化子的突变体库。

4 本实验产石杉碱甲菌株改造研究方向

本实验室在前期研究中从健康蛇足石杉植株中分离获得7株产生物碱内生真菌，其中1株菌在摇瓶条件下产生石杉碱甲，为提高产HA菌株的活性，我们采用诱变育种的方法对菌株进行实验室驯化。目前，在产石杉碱甲菌种选育方面，国内外多以菌体细胞为作用对象，采用各种物理诱变和化学诱变手段进行改造，而以原生质体作为诱变对象以期获得HA高产菌株尚未见相关研究和报道。本项目通过研究不同因素对HA产生菌原生质体制备与再生的影响，以期获得原生质体制备和再生的最佳条件，为下一步诱变育种获得HA高产菌株提供条件，也为原生质体的融合和进一步菌株基因的开发利用打下了基础。

鉴于目前国内外生物合成途径中面临的巨大技术难点是从野生蛇足石杉中分离获得野生菌株产HA含量较低，且野生菌株在长期脱离宿主植株后将会丢失产石杉碱甲能力，因此本实验室研究解决的关键科学问题之一就是克隆石杉碱甲生物合成基因，构建产HA菌株转化体系和克隆载体生物表达体系，让高产有效基因可以长期稳定存在于菌株中。此外，通过对产HA菌株高产有效基因进行测序，在分子水平上阐明高产有效基因表达的新的酶蛋白参与HA生物合成机理又是本实验室解决的另一个关键问题。通过能基于以上研究提出新的生物合成HA研究方法，解决临床用药问题；提出新的研究策略，指导濒危植物有效成分生物合成在分子水平上的研究；提出新的科学假设，揭示全新合成机制。

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Progress on the research methods for developing new resources of huperzine A.

HAN Wen-xia1,SONG Tao2,LI Wei-ze1,ZHANG Han1,SHAO Ming-ming1,WU Yong-hong1.
1.Department of Medical Technology,Xi'an Medical University,Xi'an 710021,Shaanxi,CHINA;2.Clinic,Department of Administrative Affairs,Air Force Engineering University,Xi'an 710051,Shaanxi,CHINA

Huperzine A recently serves as the first-line drug for treating Alzheimer's disease.This paper reviews the latest progress in source and development of Huperzine A from the comprehensive angles of drug needs and pharmaceutical industry.The development of transformation methods in future is prospected.Extraction from natural herbs,as the most convenient way for obtaining huperzine A,has a long history and still has great vitality.However, the method has been faced with a bottleneck of limited plant resources.Chemical synthesis is still one of the important ways for development of huperzine A,but it has the disadvantages of trivial steps,high cost and difficulty in obtaining composites with pure optical activity.Now,adopting biological techniques to obtain huperzine A from endophytic fungi and fermentation of H.serrata has been making great progress.It is recognized that utilizing biological techniques for transformation would become one of the important directions in industrial production of huperzineA.

Alzheimer's disease;HuperzineA;H.serrata;Endophytic fungi;Transformation

R969.4

A

1003—6350（2015）15—2275—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.15.0819

2015-03-01)

国家自然科学基金(编号：81303231)；陕西省教育厅科学研究项目(编号：14JK1632)；陕西省大学生创新创业训练计划项目(编号：1753、1636）

韩文霞。E-mail：wenxiahanwendy@163.com