中草药对4 种南美白对虾致病菌的抑制效果筛选

陈 琛 王发秀② 张赛乐 闫茂仓 *③ 柴雪良 於俊琦 谢起浪

（①浙江省海洋水产养殖研究所 浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室 浙江 温州 325005 ②温州医科大学生命科技学院 浙江 温州 ③宁波大学海洋学院 浙江 宁波）

中草药具有天然、高效、毒副作用小、抗药性不显著、资源丰富以及性能多样等优点，不但能直接抑菌还能提高水产动物的抗病力，在水产养殖中的应用越来越受到关注。目前多见中草药防治鱼类疾病的研究报道，而关于中草药防治南美白对虾致病菌的应用报道还不多[11]。本研究采用体外抑菌法从23味中草药中筛选抑制南美白对虾致病弧菌的中草药，旨在为中草药在防治南美白对虾弧菌病中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 中草药 试验用的23种中草药为艾叶、白术、黄连、牡丹皮、甘草、诃子、乌梅、五倍子、鱼腥草、黄柏、肉苁蓉、茯苓、连翘、大黄、金银花、猪苓、板蓝根、黄芪、杜仲、贯众、黄芩、柴胡和山豆根，均购自浙江省温州市中医院。

1.1.2 致病弧菌 4种南美白对虾致病菌菌株由本实验室分离保存。分别是DX1203(副溶血弧菌)、DX1304(哈氏弧菌)、DX0901(鳗弧菌)和DX0801(需钠弧菌)。

1.2 方法

1.2.1 药液的制备 称取艾叶等23味中草药各25g，切细研磨，加250mL蒸馏水，煮沸30min,过滤，药渣再加水250ml，煮沸30min，过滤，合并2次滤液，加热蒸发浓缩至25ml，使生药含量为1g/ml。4℃冰箱保存备用。

1.2.2 菌液的制备 将冷藏的四种弧菌(与牛奶混合冷冻)取部分于ZOBELL2216E液体培养基28℃培养24h，移取200μl 加 入ZOBELL2216E 液 体 培 养 基 中 培 养28℃培 养24h，用液体培养基作1:100倍稀释后备用，供试菌液浓度在1×106CFU/ml。

1.2.3 最小抑菌浓度(mIC)的测定 首先配置ZOBELL液体培养基，然后每味中草药组取150×15mm无菌试管10支，并另取2管做阴阳对照，每支试管加入10ml液体培养基。以10ml移液枪移取已制备好的药液5ml加入第一管中，混匀后吸取5ml加入第二管中，依次倍比稀释至第10管，弃去5ml。重复上述操作做为观察对照组。118℃灭菌15min。1～10管以及阳性对照管加入菌液100μl，混匀，28℃培养24h后观察结果，对照组和阴性对照管不加菌，凡是与对照组比较药物最高稀释广众清澈透明、无细菌生长者，该管的浓度即为该菌mIC。

1.2.4 最小杀菌浓度(mBC)的测定 在mIC实验基础上，从无明显细菌生长的各管取材，分别分别涂布于相应的TCBS平板培养基，于恒温培养箱培养48h，观察结果。琼脂平板上无细菌生长且含药液最少的一管的药液浓度，即为该种药物对该菌的mBC。

2 结果与分析

2.1 23种中草药对副溶血弧菌DX1203的抑菌效果

23味中草药对副溶血弧菌DX1203的抑菌效果如表1所示。各组中草药均有一定的抑菌效果，以相同量的药物提取液进行抑菌试验，抑菌效果强弱不同；其中五倍子，诃子，黄芩和大黄抑菌效果最好，mIC分别为0.06、0.036、0.98和0.98mg/ml；mBC也以这四味最低，分别为0.12、0.24、0.98和1.95mg/ml。乌梅、艾叶、连翘、黄连、牡丹皮和金银花等也表现出了较高的抑菌和杀菌能力，但浓度稍高于上述四味中草药，抑菌浓度为1.95～3.91mg/ml，杀菌浓度为3.91～15.63mg/ml。

表1 23味中草药对副溶血弧菌DX1203的mIC、mBC (mg/ml)

2.2 23种中草药对哈氏弧菌DX1304的抑菌效果

23味中草药对哈氏弧菌DX1304的抑菌效果如表2所示。各组中草药均有一定的抑菌效果，以相同量的药物提取液进行抑菌试验，抑菌效果强弱不同；其中五倍子，诃子，黄芩和大黄抑菌效果最好，mIC 分别为0.001、0.03、0.49和0.24mg/ml；mBC也以这四味最低，分别为0.008、0.24、0.98和0.98mg/ml。乌梅、艾叶、连翘、黄连、牡丹皮和金银花等也表现出了较高的抑菌和杀菌能力，但浓度稍高于上述四味中草药，抑菌浓度为1.95～7.81mg/ml，杀菌浓度为1.95～62.50mg/ml。

表2 23味中草药对哈氏弧菌DX1304的mIC、mBC (mg/ml)

2.3 23种中草药对鳗弧菌DX0901的抑菌效果

23味中草药对鳗弧菌DX0901的抑菌效果如表3所示。各组中草药均有一定的抑菌效果，以相同量的药物提取液进行抑菌试验，抑菌效果强弱不同；其中五倍子，诃子，黄芩和大黄抑菌效果最好，mIC分别为0.24、0.49、0.98和1.95mg/ml；mBC也以这四味最低，分别为0.24、0.49、0.98和1.95mg/ml。乌梅、艾叶、连翘、黄连、牡丹皮和等也表现出了较高的抑菌和杀菌能力，但浓度稍高于上述四味中草药，抑菌浓度为3.91～7.81mg/ml，杀菌浓度为1.95～7.81mg/ml。

表3 23味中草药对鳗弧菌DX0901的mIC、mBC (mg/ml)

2.4 23种中草药对需钠弧菌DX0801的抑菌效果

23味中草药对需钠弧菌DX0801的抑菌效果如表4所示。各组中草药均有一定的抑菌效果，以相同量的药物提取液进行抑菌试验，抑菌效果强弱不同；其中五倍子，诃子，黄芩和大黄抑菌效果最好，mIC 分别为0.001、0.004、0.49和1.95mg/ml；mBC也以这四味最低，分别为0.015、0.49、0.98和3.91mg/ml。乌梅、艾叶、连翘、黄连、牡丹皮、金银花、柴胡、贯众和黄芪等也表现出了较高的抑菌和杀菌能力，但浓度稍高于上述四味中草药，抑菌浓度为1.95～7.81mg/ml，杀菌浓度为1.95～ 7.81mg/ml。

表4 23味中草药对钠需弧菌DX0801的mIC、mBC (mg/ml)

3 讨论

本研究结果显示，在试验条件相同的情况下，五倍子、诃子、黄芩和大黄对凡纳滨对虾哈氏弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌和需钠弧菌等几种致病弧菌表现出较强的抑菌效果，说明这些中草药中含有可以抑制甚至杀灭弧菌的有效成分。因此采用中草药来预防上述几种致病弧菌引起的凡纳滨对虾细菌性疾病是确实可行的。其中以五倍子的抑菌效果最佳，表明五倍子是23味中草药中最佳的用于防治南美白对虾弧菌病的药物。4种致病菌中需钠弧菌的药物敏感性最好，药物抑菌浓度最低。从抑菌效果可以看出，各组药物提取液对弧菌的抑菌效果差别较大，这与各组药物的成分组成和含量不同有关。中草药具有廉价、来源广、低毒、副作用小、不易产生抗药性等特点，且药中某些成分既有抗菌作用，又有免疫作用，能改善机体的免疫状态，提高自身抗菌能力。本研究为进行中草药提升免疫力、筛选出具有研究应用价值的中草药提供了基础。

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