中药对大鼠脑缺血再灌注损伤细胞凋亡机制的研究进展

邓文祥，潘继兴，黄惠勇*

（湖南中医药大学，湖南 长沙410208）

脑血管疾病一直严重危害人类健康，其中脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI） 的病理生理过程在这一疾病及其相应的治疗过程中发挥着重要的作用。 近年来国内外的研究显示细胞凋亡与CIRI 的关系密切，现将有关凋亡机制以及中药及其有效成分对抗CIRI 细胞凋亡研究综述如下。

1 CIRI 神经元细胞凋亡相关机制

CIRI 细胞凋亡的发生与凋亡基因的表达以及许多内外因素的调节有关[1]，可能涉及如下几个方面。

1.1 大量氧自由基产生

氧自由基主要来源于线粒体，缺血后线粒体产生氧自由基的刺激因素包括低氧、谷氨酸兴奋性中毒、Ca2+超载等，另外再灌也是氧自由基增高的原因之一，因再灌后O2-产生显著增加。脑缺血发生后，产生大量的氧自由基以及内源性抗氧化剂失活导致神经元的氧化性损伤，卒中后凋亡的触发分子——高毒性分子过氧亚硝酸盐，由增加的O2-与NO 相互作用形成。 研究表明，及时清除脑缺血后产生的氧自由基不仅可以通过下调核转录因子-κB (NF-κB)和原癌基因C-myc 的表达，同时还能降低海马CA1区神经细胞的损伤以及DNA 的断裂从而减少凋亡发生[2-4]。

1.2 钙超载

现已认为， 细胞内Ca2+超载是缺血性神经元损伤的共同途径，Ca2+超载时， 大量的Ca2+内流引起线粒体膜损伤，对细胞氧化还原反应、渗透压、pH 值、细胞内信号的维持都有重要的影响；Ca2+超载可促进膜磷脂分解；在膜磷脂分解过程中产生的游离脂肪酸、前列腺素、白三烯、溶血磷脂等细胞有害物质，降低脂质膜流动性，同时增高脂质膜的通透性，导致细胞肿胀； 同时钙依赖蛋白酶被激活，导致细胞内无害的黄嘌呤脱氢酶转变为有害的黄嘌呤氧化酶，生成大量氧自由基；Ca2+超载时，释放到细胞外间隙的兴奋性氨基酸可造成细胞毒性[5]。

1.3 线粒体损伤

线粒体介导的细胞内凋亡是哺乳动物细胞凋亡的途径之一， 线粒体引起细胞凋亡可能与以下3种机制相关：（1）破坏电子传递、氧化磷酸化和ATP产生；（2） 线粒体的线粒体膜通透性转换孔（MPTP）在各种促细胞凋亡信号作用下开放，导致线粒体跨膜电位崩解，呼吸链解耦联，线粒体基质渗透压升高，内膜肿胀；（3）细胞色素C、凋亡诱导因子等促凋亡因子的释放，细胞色素C 进入胞浆与胞浆内凋亡蛋白酶激活因子1 及三磷酸脱氧腺苷结合引发含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）级联反应，诱导细胞凋亡[6-8]。

2 单味中药及其提取物抗大鼠CIRI 细胞凋亡的研究进展

2.1 补虚类

黄芪为临床上常治疗脑缺血疾病的药物，Huang XP 等[9-10]发现黄芪注射液可以抑制大鼠CIRI 模型缺血区氨基末端激酶3 (JNK3)mRNA 和蛋白质的表达，以及磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)，磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)的表达，从而抑制JNK 信号传导通路的活化，改善细胞能量代谢，抑制凋亡的线粒体途径。 刘莎莎等[11]发现黄芪注射液可抑制大鼠CIRI 模型海马神经元凋亡相关蛋白Caspase-3 的表达，且6 mL/kg 效果最佳。刘瑞等[12]发现黄芪注射液还可抑制大鼠CIRI 模型海马神经元凋亡蛋白酶激活因子1 蛋白表达。 许亮等[13-14]发现黄芪甲苷（AST）具有减轻大鼠CIRI 模型半暗带区神经细胞凋亡的作用， 且AST 40 mg/kg 对神经元保护效果最佳，其机制可能与增加脑源性神经营养因子(BDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)及VEGF 受体的表达有关。 王莹等[15]发现黄芪皂苷Ⅳ联合骨髓基质干细胞（BMSCs）移植可明显抑制CIRI 大鼠神经元细胞凋亡，其机制可能与黄芪皂苷Ⅳ促进BMSCs上调Livin 蛋白表达，下调Caspase-9 蛋白的表达有关，从而可知黄芪可通过抑制促凋亡蛋白与基因的表达，以及相关凋亡信号的传导，上调神经保护因子的表达。

于利等[16]发现人参皂苷Rg1可下调大鼠CIRI模型大脑皮层多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1、Caspase-3 的表达，减轻脑细胞凋亡。 He B 等[17]研究发现人参皂苷Rg3的神经保护作用与抗大鼠CIRI 模型细胞凋亡作用与其下调海马CA1 区钙蛋白酶I和Caspase-3 的表达有关。Yan BY 等[18]实验发现淫羊藿次苷可以下调大鼠CIRI 模型海马CA1 区的Bax 和Caspase-3 蛋白表达， 上调Bcl-2 的表达，减少海马TUNEL 阳性神经元数和神经元的损伤。

以上结果表明，补虚类药中以补气药治疗CIRI细胞凋亡为主，中风时以“瘀”证为主要症候，“补气”对大鼠CIRI 模型具有明显的疗效，益气可以治瘀，符合中医“气为血之帅”的理论。

2.2 活血化瘀类

川芎为治疗头痛要药。 川芎的主要化学成分包括：川芎嗪、川芎内酯等。 赵秋振等[19]研究发现川芎嗪可抑制大鼠CIRI 模型凋亡相关蛋白Caspase-12表达，调节Bcl-2 和Bax 的比值。 王昀[20]发现川芎嗪可下调大鼠CIRI 模型海马神经元Bax mRNA 表达，抑制c-jun 传导通路，抑制氧化应激。Hu Y 等[21]发现川芎内酯可显著提高大鼠CIRI 模型皮质和海马组织的Bcl-2/Bax 比值，抑制Caspase-3 的表达和裂解Caspase-9。 这些结果表明，川芎的神经保护作用与其抗氧化和抗凋亡的特性有关，其抗凋亡机制可能与抑制凋亡蛋白因子有关。

《本草便读》中记载：“丹参，功同四物，能祛瘀以生新，善疗风而散结，性平和而走血”。 丹参主要活性成分包括：丹参酮IIA、丹参酚酸B 等。 Zhou HZ等[22]发现丹参可减少沙鼠CIRI 模型海马神经元凋亡数目，其机制可能与提高Bcl-2 的表达有关。丹参酮IIA可促进大鼠CIRI 模型脊髓中热休克蛋白70和Bcl-2 蛋白以及Caspase-3 的表达， 抑制Bax 蛋白的表达， 而丹参酚酸B 可以抑制大鼠CIRI 模型Caspase-3 的活化以及抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）通路，从而减少神经细胞凋亡[23-25]。 Ye KP等[26]研究发现姜黄素能显著下调自发性高血压大鼠CIRI 模型海马区c-Jun 和c-Fos 蛋白表达， 从而抑制c-Jun 氨基末端激酶（JNK）信号通路。

2.3 止血类

《本草新编》记载：“三七根，止血之神药也，无论上中下之血，凡有外越者，一味独用亦效，加入补血补气药之中则更神”， 三七的主要有效成分为三七总皂苷。 王琼等[27]发现三七总皂苷能够上调大鼠CIRI 模型脑组织中抑制凋亡蛋白XIAP 的表达和下调促凋亡蛋白Smac 的表达。唐映红等[28]发现三七总皂苷能抑制大鼠CIRI 模型脑组织中神经元凋亡信号通路JNK 信号转导蛋白的激活。 刘英吉[29]发现三七总皂苷能上调大鼠CIRI 模型脑组织中Bcl-2 和Bax 蛋白的表达和线粒体膜电位， 抑制线粒体凋亡途径， 另外三七总皂苷能下调Caspase-1 的 表 达[30]。 Meng X 等[31]发 现 三 七 皂 苷R1对大鼠CIRI 模型神经保护机制涉及通过雌激素受体依赖性激活丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（Akt）／转录因子NF-E2 相关因子2 通路，从而抑制还原型辅酶Ⅱ氧化酶的激活和线粒体功能障碍。

2.4 解表类

葛根素是葛根中提取的异黄酮类化合物，现已广泛应用于急性脑梗死的治疗。 刘必旺等[32]发现葛根素可以抑制大鼠CIRI 模型脑组织中促凋亡因子如Caspase-3 和胶质纤维酸性蛋白的表达， 上调BDNF 星形胶质细胞的表达， 以及激活PI3-K/Akt信号通路，从而减少神经细胞凋亡。王军等[33]研究发现生姜水能明显降低大鼠CIRI 模型海马TUNEL、Caspase-3、Bax 和Bcl-2 阳性细胞数， 升高Bcl-2/Bax 的比值。

从上可知，目前大多数实验依然停留在中药某些成分和∕或在CIRI 某个病理环节上的药理作用，并未充分运用中医理论指导临床用药。

3 中药复方抗大鼠CIRI 细胞凋亡的研究进展

3.1 补阳还五汤

Wang HW 等[34]提出补阳还五汤在大鼠CIRI模型脑损伤的神经保护作用可能依赖于多种靶分子或基因调控，其机制可能与抑制炎症反应、细胞凋亡和血管生成有关。 孙立倩等[35]研究发现补阳还五汤对大鼠CIRI 模型神经细胞凋亡的抑制作用，可能与其抑制大鼠CIRI 脑组织中丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)磷酸化、COX2 蛋白表达有关。 有学者提出[36-37]补阳还五汤抑制大鼠CIRI模型中JAK2/STAT3 信号通路以及p38MAPK 信号通路的激活可能也是其抗凋亡机制之一。

3.2 黄连解毒汤

Zhang Q 等[38]研究发现黄连解毒汤预处理能够减轻大鼠CIRI 模型神经元凋亡，其机制可能是通过激活PI3K/Akt 信号通路和上调HIF-1α 的表达。 龙建飞等[39]通过观察黄连解毒汤对大鼠CIRI 模型半暗带神经元，DNA 修复酶 PARP 及凋亡蛋白Caspase-3 表达的影响，发现其抗神经元细胞凋亡机制与抑制Caspase-3 的表达活性，降低NeuN、PARP 的过度表达有关。 付晓春等[40]通过探讨黄连解毒汤对大鼠CIRI 模型神经细胞凋亡的保护机制与抑制Caspase-3 的表达有关。

3.3 小续命汤

小续命汤是临床治疗中风的常用方剂，Zhu XH 等[41]研究发现小续命汤对大鼠CIRI 模型具有抗细胞凋亡的作用， 其机制可能与上调Bcl-2 蛋白的表达，从而抑制Caspase-3 蛋白的激活有关。王月华等[42]通过探讨小续命汤有效成分对慢性大鼠CIRI 模型线粒体的保护作用，发现小续命汤减轻细胞凋亡的机制与其改善线粒体的损伤有关。

3.4 血府逐瘀汤

血府逐瘀汤临床上常用于心脑血管等疾病的治疗。孙寒静等[43]实验表明，血府逐瘀汤具有减少大鼠CIRI 模型神经元细胞凋亡的作用，与其减轻脂质过氧化反应，降低丙二醛的含量，提高体内抗氧化酶超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性表达，从而降低自由基的产生有关。 高红莉等[44]研究表明，血府逐瘀汤对大鼠CIRI 模型损伤的保护作用机制，与其下调缺血大脑皮层的Bax、Caspase mRNA 的表达， 上调Bcl-2 mRNA 的表达有关。

3.5 丹龙醒脑方

丹龙醒脑方是临床治疗缺血性卒中的有效复方，全方由丹参、三七、远志、石菖蒲、地龙、淫羊藿、菟丝子等组成，其功效为活血化瘀、通利经络。 周小青等[45]通过研究发现丹龙醒脑方抗大鼠CIRI 模型神经细胞凋亡机制与其上调Bcl-2 的表达， 降低Bax 的表达有关。何倩等[46-47]研究发现丹龙醒脑片减少大鼠CIRI 模型细胞凋亡的分子机制可能与其下调脑缺血再灌注后海马区肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达以及抑制由缺血再灌注损伤诱导的凋亡蛋白Fas/FasL 的表达有关。

从而可知，中药复方对CIRI 大鼠神经元细胞凋亡的研究主要集中在凋亡相关蛋白因子，如Bcl-2、Bax、caspase 蛋白的表达， 以及相关凋亡途径的抑制，同时减轻缺血后的氧化应激反应。

4 问题与展望

综上所述，中药单体及其复方在抗大鼠CIRI 神经元细胞凋亡方面发挥重要作用，但仍然存在着一些问题。 首先，现阶段的研究局限于以单味中药的功效为出发点，探讨其有效成分对CIRI 细胞凋亡的保护作用，以西医疾病为基础建立的动物模型不能充分体现中医的辨证论治。 再者，由于中药有效成分的复杂性，大多数实验依然停留在中药某些成分和/或在某个病理环节上的药理作用， 中药多层次、多途径、多环节、多靶点综合干预的特点未能体现。最后， 中药复方研究报道与中医辨证论治结合较少，方剂是中医临床治疗疾病的重要手段，是在辨证、立法的基础上选药配伍而成的，脱离辨证施治对中医研究意义有限。

中医证候动物模型的研制尚处于探索阶段，对动物模型的辨证论治并不理想，脱离临床实际。 因此，依托中医理论的指导，运用现代科学技术建立行业认可的造模方法和模型评价体系，包括中医理论指导下复制病证结合的神经细胞凋亡模型的建立，是解决问题的关键。

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