补肾祛斑颗粒治疗黄褐斑的血清药理学研究

汤 慧，李 峰，程晓峰，陈艳秋，白 雯，汤迎爽，李世梅

(1. 解放军第323医院，陕西 西安 710056；2. 西安交通大学第一附属医院，陕西 西安 710061)

补肾祛斑颗粒治疗黄褐斑的血清药理学研究

汤 慧1，李 峰2，程晓峰1，陈艳秋1，白 雯1，汤迎爽1，李世梅1

(1. 解放军第323医院，陕西 西安 710056；2. 西安交通大学第一附属医院，陕西 西安 710061)

目的 通过体外实验阐述补肾祛斑颗粒治疗黄褐斑的血清药理学作用机制。方法 按临床用量的24，12，6倍作为本实验的高、中、低剂量组对大鼠灌胃并提取含药血清，对照组灌入生理盐水。A375和B16细胞作为本实验的研究对象，含药血清处理24h、48h和72h后检测细胞活性、黑色素含量及酪氨酸酶活性。结果 补肾祛斑颗粒含药血清能明显促进A375和B16细胞增殖且呈浓度依赖和时间依赖效应。其能显著抑制细胞内黑色素含量及酪氨酸酶活性。结论 补肾祛斑颗粒通过抑制细胞内酪氨酸酶的活性抑制细胞内黑色素的合成，从而起到治疗黄褐斑的药效。

黄褐斑；补肾祛斑颗粒；含药血清；细胞活性；黑色素；酶氨酸酶活性

黄褐斑是临床常见的颜面皮肤色素沉着性损容性疾病，多见于女性，其临床表现以面部呈对称蝴蝶状,或局限性褐色或淡褐色斑片为特点。虽无不适症状，但严重影响患者的身心健康。前期临床对辨证为肾虚血瘀型黄褐斑患者采用补肾祛斑颗粒治疗，收到良好疗效，且无不良反应[1]。现对补肾祛斑颗粒进行血清药理学体外实验，以探讨其消斑作用机制。

1 实验资料

1.1材料

1.1.1实验药物 补肾祛斑颗粒：解放军第323医院药厂生产，科研用药。

1.1.2实验动物 SPF级成年雌性SD大鼠20只，购买并饲养于西安交通大学医学院实验动物中心，动物合格证号：SCXK2007-001。

1.1.3实验细胞 A375人黑素瘤细胞、B16小鼠黑色素瘤细胞，均为西安交通大学医学院中心实验室馈赠。

1.1.4主要试剂 胰蛋白酶、MTT、酪氨酸、酪氨酸酶、左旋多巴购自Sigma公司，无酚红DMEM培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素母液，购自Gibico公司；三氯乙酸、乙醇、氢氧化钠、碳酸氢钠、二甲基亚砜(DMSO)、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、水合氯醛，购于西安交通大学试剂科。

1.1.5主要仪器 NAPCO-5410型CO2培养箱、OLYMPUS倒置显微镜、Bio-Teck多功能酶标仪、水浴锅、高压灭菌锅、冰箱、超净台、Millipore一次性滤器、电热恒温干燥箱、普通离心机、水平离心机、培养皿、96孔板、48孔板、6孔板、离心管、吸管、加样枪及其枪头、微量振荡器，由西安交通大学医学院中心实验室提供。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 将A375和B16分别培养于含10%胎牛血清的无酚红DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2孵育箱中。待细胞状态良好，呈对数生长时，PBS洗3遍，0.25%胰酶消化，PBS中和后离心，按实验要求种板。培养基中均含有青霉素和链霉素。

1.2.2含药血清的制备 补肾祛斑颗粒以临床单次用量的24,12,6倍作为本实验的高、中、低剂量。将大鼠分为生理盐水组、补肾祛斑高剂量组、补肾祛斑中剂量组、补肾祛斑低剂量组，每组5只，分别灌胃生理盐水及相应剂量补肾祛斑颗粒，2次/d，共3 d。末次给药前8 h禁食不禁水。末次给药1 h后腹腔注射1%水合氯醛麻醉，下腔静脉采血并分装于离心管中。水平离心机3 000 r/min离心20 min，吸取上层血清于无菌离心管中，再次离心。取上清于离心管中，经56 ℃恒温水浴30 min处理灭活补体后分装，置-20 ℃冻存备用[2]。所有操作尽可能做到无菌。

1.2.3细胞增殖情况测定 采用MTT法测定。细胞悬于无血清培养基，按4 500个/孔种于96孔板，每孔100 μL，每组6个副孔。过夜后弃去旧培养基，每孔加入200 μL含10%不同血清组血清的培养基。达到处理时间后，每孔加入MTT母液20 μL，混匀后放回细胞培养箱。4 h后弃上清液，加入DMSO 150 μL/孔，振荡5 min左右，置于酶标仪，波长490 nm测定OD值。

1.2.4酪氨酸酶活性测定 取各血清组血清100 μL于48孔板中，每组设6个副孔。加pH 6.8磷酸盐缓冲液56 μL与2.0 mmol/L的酪氨酸溶液94 μL,混合均匀后在冰水浴中迅速加入50 μmol/L的酪氨酸酶溶液50 μL，混匀，37 ℃孵育10 min，于490 nm处测定各孔OD值。

1.2.5细胞酪氨酸酶活性测定 采用多巴色素法测定。细胞悬于无血清培养基，按15万个/孔种于6孔板，每孔1 mL。过夜后弃去旧培养基，每孔加入含10%不同血清组血清的培养基2 mL。达到处理时间后，弃去培养基，PBS洗3遍，胰酶消化后离心，PBS重悬、计数，按每孔2万个细胞种于96孔板，每孔50 μL，每组设6个副孔。每孔加2% TritonX-100溶液50 μL，混匀后迅速置-80 ℃冻存30 min，随后室温融化使细胞完全破裂，37 ℃预温后加入1%左旋多巴溶液20 μL，37 ℃反应2 h，测定490 nm处的OD值，即代表酪氨酸酶活性[3]。

1.2.6细胞内黑色素含量测定 采用NaOH小时溶解法测定。细胞处理同上,取12万个细胞于EP管中,超声破碎,离心,沉淀用10%三氯乙酸和乙醇洗涤,1 200 r/min离心5 min，倾上清液，加入1 mL含10%DMSO的1 mmol/L NaOH溶液，80 ℃水浴2 h后按每孔150 μL种于96孔板，490 nm测OD值，即代表黑色素含量[3]。

1.3统计学方法 使用Graphpad prism 5及photosho7.0对实验数据进行整理并做图。采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析。P<0.0为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组A375和B16增殖情况比较 在24 h时，含药血清对细胞增殖的影响不明显，仅A375在高剂量组相对于对照组增殖加快，且差异有统计学意义。随着处理时间的延长，相比于对照组，含药血清促增殖效应突出，并存在显著的时间梯度依赖和浓度梯度依赖效应。另外，相对于B16，A375对含药血清更为敏感。说明补肾祛斑颗粒在使用过程中并不是通过影响细胞活性来起到祛斑的效果。见图1及图2。

2.2各组A375和B16内黑色素含量比较 在处理24h时，含药血清对A375和B16细胞内黑色素含量的影响并不明显。随着处理时间的延长，含药血清对黑色素含量的降低效应越来越突出，呈现明显的时间梯度依赖和浓度梯度依赖效应(P<0.05)。由此可以发现，补肾祛斑颗粒的确切疗效主要是其能够降低细胞内黑色素的含量。见图3及图4。

图1 各组A375细胞增殖情况

图2 各组B16细胞增殖情况

图3 各组A375细胞内黑色素含量

图4 各组B16细胞内黑色素含量

2.3各组酪氨酸酶自身活性比较 各组酪氨酸酶活性比较差异均无统计学意义。见图5。

2.4各组A375和B16内酪氨酸酶活性比较 在处理24 h时，含药血清对A375和B16细胞内酪氨酸酶活性的影响并不明显，仅高剂量组含药血清能部分抑制其活性。随着处理

图5 各组酪氨酸酶自身活性比较时间的延长，含药血清对酪氨酸酶活性的抑制效应越来越突出，且呈现明显的时间梯度依赖和浓度梯度依赖效应。见图6和图7。

图6 各组A375细胞内酪氨酸酶活性

图7 各组B16细胞内酪氨酸酶活性

3 讨 论

黄褐斑属于祖国医学“黧黑斑”范畴，黄褐斑的发生与肝脾肾功能失调、气血瘀滞、面容失于濡养关系密切，临床上根据不同证型采取相应治疗。补肾祛斑颗粒是解放军第323医院科研制剂，由枸杞子、菟丝子、覆盆子、补骨脂、当归、白

芍、川芎、蒲黄、土鳖虫组成。其中枸杞子、菟丝子补肾气，益精血，补而不腻为君药；当归、白芍、川芎补血活血，补而不滞为臣药；佐以覆盆子、补骨脂、蒲黄、土鳖虫固肾，祛瘀，行血消斑。诸药合用，共奏补肾益精、养血活血、化瘀祛斑之功效，适用于肾虚血瘀型黄褐斑。

补肾祛斑颗粒在临床使用中效果明显，对辨证准确、药证相合的黄褐斑患者，起效快者可在用药3 d即可见黄褐斑的面积及程度均有减少。在体外研究中，补肾祛斑颗粒通过大鼠代谢，其有效成分会贮存于血清之中，本实验方法提取的血清中药物有效成分浓度高、效价高[4]。细胞实验表明补肾祛斑颗粒并不是通过抑制细胞活性而发挥药效，其能促进黑色素细胞的增殖，促进黄褐斑患者黑色素细胞的新陈代谢与局部修复，与药物的补肾养血活血效应相符合。含药血清处理后，细胞中黑色素的含量明显降低，且随着作用时间的延长以及药物浓度的增加，效应愈加明显。细胞内酪氨酸酶活性的强弱直接与黑色素的量呈正相关[5]，其在黑色素的合成中起到至关重要的作用。含药血清本身并不能影响酪氨酸酶的活性，但通过细胞代谢后，其能显著抑制酪氨酸酶的活性，从而抑制细胞内黑色素的合成。提示补肾祛斑颗粒能明显抑制黑色素细胞内黑色素的合成，其抑制细胞内酪氨酸酶活性是潜在的重要途径。补肾祛斑颗粒具体是如何抑制酪氨酸的活性，是否同时促进了黑色素的代谢从而使细胞内黑色素含量降低以及其分子机制还有待后续研究。

[1] 李世梅,程小红,房武宁,等. 补肾祛斑颗粒治疗黄褐斑98例疗效观察[J]. 新中医,2008,40(7):21-22

[2] 李世梅. 宫瘤清含药血清对子宫肌瘤作用机理的实验研究[D]. 成都：成都中医药大学,2002

[3] 郑锦芬. 白藜芦醇对培养的人黑素细胞的影响[D]. 汕头：汕头大学,2009

[4] 张军平,张伯礼,山本清高，等. 中药药物血清的制作方法探讨[J]. 天津中医药,2004,21(4):274-276

[5] 向亚萍. 肾着祛斑颗粒剂对黄褐斑及黑素影响的研究[D]. 长沙：湖南中医学院,2003

Study on the serum pharmacology of Bushen Quban granule in the treatment of chloasma

TANG Hui1, LI Feng2, CHENG Xiaofeng1, CHEN Yanqiu1, BAI Wen1, TANG Yingshuang1, LI Shimei1

(1.The 323th Hospital of PLA, Xi’an 710056, Shaanxi, China; 2.The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi, China)

Objective It is to explore the mechanism of serum pharmacology of Bushen Quban granule in the treatment of chloasma through experiments in vitro. Methods Bushen Quban granule was administrated to rats at the doses which were 24，12 and 6 folds higher than that used in the clinic while normal saline was used as the control. After three days treatment, drug serum was extracted. A375 and B16 were treated with drug serum for 24 h, 48 h and 72 h and then cells viability, the content of melanin and the activity of tyrosinase were assessed. Results Drug serum could promote cells viability in dose and time dependent manner,it could significantly reduce the content of melanin within cells and inhibit tyrosinase activity. Conclusion Bushen Quban granule inhibits tyrosinase activity to reduce the synthesis of melanin to cure chloasma

chloasma; Bushen Quban granule; drug serum; cells viability; melanin; tyrosinase’s activity

汤慧，女，硕士，医师，研究方向为中医临床。

李世梅，E-mail：262420592@qq.com

兰州军区基金资助课题(CLZ12JB32)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.08.002

R-332

A

1008-8849(2015)08-0802-03

2014-09-30