非压迫性椎间盘髓核突出致神经根损伤中自身免疫反应的研究

袁伟杰 袁子薇 王锐英 胡军祖 (桂林医学院附属医院骨科，桂林 541001)

腰腿痛病因繁多，腰椎间盘突出症是其最常见的原因之一。传统观点认为，腰椎间盘突出症是椎间盘纤维环破裂，髓核突出压迫神经根所表现的一种综合征。然而在临床实践中，许多患者没有明显的神经根受压，却有严重的神经根性症状。目前有学者已经证明在椎间盘退变中存在自身免疫反应［1］，但自身免疫反应对神经根损伤的具体机制研究较少。本实验通过检测非压迫性椎间盘髓核突出模型中T 细胞、TNF-α 表达，探讨非压迫性椎间盘髓核突出中自身免疫反应致神经根损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象及分组 雌性SD 大鼠48 只(桂林医学院动物实验中心)，体重300～350 g，采用随机数字表随机分为2 组:模型组及对照组，每组24 只。同一组中每2 只饲养于一个钢丝笼中，实验室温度为22℃～26℃，每日早晨8:00 至20:00 开灯，20:00至次日8:00 熄灯。

1.2 主要试剂 抗大鼠APC 标记CD3/PE 标记CD4/FITC 标记CD8 抗体购自美国BD 公司;淋巴细胞分离液购自北京索菜宝科技有限公司;TNF-α ELISA 试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司。

1.3 造模方法 动物造模［2］:戊巴比妥钠45 mg/kg 腹腔注射麻醉，备皮，消毒，背部正中切口，长约3 cm，依次切开皮肤及皮下组织，从棘突左侧钝性分离椎旁肌，暴露腰4、5 椎间关节及横突，微型咬骨钳去除腰4、腰5 左侧椎板及关节突，用显微器械小心显露腰4、腰5 神经根。取大鼠自体2～8 尾椎共计6 个椎间盘髓核组织，轻轻置于腰4、腰5 神经根旁，注意不要造成机械压迫，逐层缝合切口。术后3 d连续腹腔注射青霉素30 万U/(只·d)，预防切口感染。对照组采用同样的手术方式，神经根旁不放置髓核组织。

1.4 观测项目 观察两组大鼠的行为学变化;术后10 d、20 d、40 d 时，每组随机抽取8 只，参考文献［3］用血压计自制测量器检查左后肢痛阈;腹主动脉采血4 ml，2 ml 用枸橼酸钠抗凝管采集，淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，流式细胞仪检测CD4+、CD8+T 细胞百分比;另外2 ml 用干燥试管采集，离心后收集上层血清，ELISA 法测定血清中TNF-α 水平;HE 染色观察腰4、腰5 神经根形态学变化。

1.5 统计学方法 运用SPSS18.0 统计软件做统计分析，实验数据以±s 表示。计量资料符合正态分布，采用独立样本t 检验，P ＜0.05 差异有统计学意义。

2 结果

模型组术后逐渐出现多动、易激惹，近40 d 时恢复正常;而对照组未出现多动、易激惹情况。观察期间两组大鼠后肢活动均自如，饮食正常，无大小便失禁。模型组在10 d、20 d 时左后肢痛阈较对照组降低，P值＜0.05，有统计学意义;在40d时两组痛阈比较，P 值＞0.05，无统计学意义。在10 d、20 d时，模型组CD4+T 细胞比例、血清TNF-α 水平均高于对照组，CD8+T 细胞比例低于对照组，P 值＜0.05，差异有统计学意义;在40 d 时，两组CD4+T细胞比例、CD8+T 细胞比例、血清TNF-α 水平比较，P 值＞0.05，无统计学意义(见表1～4，图1)。模型组10 d 时腰神经根横断面髓鞘部分崩解，呈空泡变;20 d 时最严重，神经纤维排列不规律，大小不一，髓鞘崩解，空泡样变严重;40 d 时基本恢复正常。对照组10、20、40 d 时腰神经根横断面神经纤维排列规律，大小基本一致，髓鞘完整，呈红色，位于轴突周围。见图2。

表1 造模后10 d、20 d、40 d 左后肢痛阈(mm/Hg)Tab.1 Left hind leg pain threshold after ten days，twenty days and forty days after building(mm/Hg)

表2 造模后10 d、20 d、40 d CD4 +T 细胞比例(%)Tab.2 Proportion of CD4 + T cells after ten days，twenty days and forty days after building

表3 造模后10 d、20 d、40 dCD8 +T 细胞比例(%)Tab.3 Proportion of CD8 + T cells after ten days，twenty days and forty days after building(%)

表4 造模后10 d、20 d、40 d TNF-α 表达(pg/ml)Tab.4 Levels of TNF-α after ten days，twenty days and forty days after building(pg/ml)

图1 造模后10 d、20 d、40 d 大鼠动脉血CD4 +、CD8 +T细胞水平Fig.1 Artery levels of CD4 +，CD8 +T cells after ten days，twenty days and forty days after building

图2 造模后10 d、20 d、40 d 大鼠神经根横断面HE 染色(×400)Fig.2 Nerve root changes by HE after ten days，twenty days and forty days after building(×400)

3 讨论

临床上常见腰腿痛患者，严重影响着人们的生活质量。Rodrigues-Pinto 等研究发现，40% 的腰痛患者，归因于腰椎间盘变性［4］。目前已证明在腰椎间盘退变中存在自身免疫反应，髓核具有自身免疫原性，被纤维环包围与外界隔绝，被称为“隐蔽抗原”，一旦纤维环破裂，髓核与外界接触，即引起自身免疫反应［5］。Kimura 等［6］通过对Sprague-Dawley大鼠的研究，发现椎间盘髓核可导致神经根损伤。甚至有学者通过Sprague-Dawley 大鼠动物实验发现，单纯物理压迫并不会降低大鼠的痛阈，而髓核合并物理压迫双重因素下可明显降低大鼠痛阈［7］。本研究发现模型组术后10 d、20 d 神经根可见损伤，40 d 时神经根基本恢复正常。进一步提示椎间盘突出早期髓核可导致神经根损伤，给患者带来巨大的痛苦，自身免疫反应可能参与该损伤。因此，研究早期自身免疫反应对神经根的损伤的具体机制意义重大。

T 淋巴细胞在机体免疫系统内，是功能重要的一大细胞群，CD4+T 细胞具有辅助B 细胞产生抗体和辅助其他T 细胞亚群功能;CD8+T 细胞具有抑制B 细胞产生抗体和抑制其他淋巴细胞的功能。CD4+T 细胞和CD8+T 细胞的平衡与自身免疫性疾病的发生发展密切相关［8］。

本实验建立非压迫性椎间盘髓核突出模型，排除神经根受压迫或牵拉因素。在10 d、20 d 时，模型组和对照组比较，CD4+T 细胞比例升高，CD8+T 细胞比例降低;在40 d 时，两组CD4+、CD8+T 细胞比例相当。提示模型组早期存在T 细胞介导的自身免疫，从而引起神经根损伤，导致大鼠后肢痛阈降低，椎间盘髓核参与该反应，考虑可能通过以下几种方式造成神经根损伤:(1)椎间盘髓核通过激活CD4+T 细胞，使得B 细胞产生更多的髓核相关抗体，抗原抗体复合物的沉积可激活炎症反应而导致神经根的损伤。另外，抗原抗体反应过程本身可产生大量的炎症因子，进一步损伤神经根;(2)CD8+T细胞减低，免疫抑制作用减弱，也可导致抗原抗体反应的增强;(3)椎间盘髓核本身可激活T 细胞亚群，破坏T 细胞亚群的平衡，而爆发大量的炎症反应，损伤神经根。由于T 细胞介导的免疫反应中可释放大量炎性因子，损伤神经根，因此，研究神经根损伤的具体致炎因子，对神经根损伤的预防尤为重要。

临床实践中，有些椎间盘突出患者应用甾体或非甾体类抗炎药同样能达到缓解或治愈疼痛的效果，从而达到手术治疗的目的［9］。手术中也常常发现神经根表现出充血、水肿等炎症样变化。TNF-α作为重要的炎性介质可能与椎间盘所致腰背部疼痛有关［10］。本实验模型组在10 d、20 d 时，神经根可见损伤，TNF-α 表达明显高于对照组，差异有统计学意义;在40 d 时，神经根损伤基本恢复正常，模型组TNF-α 表达与对照组比较，差异无统计学意义，说明在椎间盘髓核突出早期TNF-α 可能是神经根损伤主要致炎因子。TNF-α 大多是由活化的巨噬细胞分泌而来。有文献指出CD4+T 细胞的Th1 细胞亚群分泌IFN-γ、淋巴毒素α 和IL-2，可促进巨噬细胞活化［11］。因此T 细胞介导的免疫反应可间接刺激TNF-α 分泌，从而使TNF-α 表达增高。TNF-α 促进PLA2 的释放，激活基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9 产生对基底膜的降解而损伤神经根。

根据以上结果推断，椎间盘髓核突出早期可能通过T 细胞介导的免疫反应使TNF-α 分泌增多引起神经根损伤，从而出现神经根性疼痛，故腰椎间盘髓核突出初期，可给予抗免疫、抗炎治疗，减轻自身免疫及炎症反应对神经根的损伤，减轻患者症状。本实验通过研究椎间盘髓核突出后T 细胞亚群及TNF-α 的变化，探讨自身免疫反应对椎间盘髓核致神经根损伤中的作用机制，有助于加深人们对椎间盘髓核突出后腰腿疼发病机理的认识，更好地指导临床对本病的治疗。

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