常温等离子体诱变选育醋酸发酵菌株

邓洪钧，白晓磊，方 昕，余森泉，郑 宇，王 敏*

(1．工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300457;

2．天津科技大学信息化办公室，天津300222)

醋酸菌(Acetic acid bacteria)是一类能将乙醇氧化成醋酸等产物的细菌。醋酸菌具有较强的氧化乙醇生成醋酸的能力，且具有较高的醋酸耐受性，被广泛用于食醋液态发酵生产，也是在食醋固态发酵生产过程中的主要产酸菌［1］。醋酸菌通过定位于细胞膜上的依赖辅酶PQQ(吡咯喹啉醌)的乙醇脱氢酶和乙醇脱氢酶完成从乙醇到醋酸的生化反应［2］。

对醋酸发酵来说，菌株的发酵效率是决定生产效率的主要因素。醋酸菌的醋酸发酵最适温度为30～32℃。如果发酵温度能够由30℃提高到37℃，那么发酵冷却成本可以降低约50%，因此优良醋酸发酵菌种的选育对食醋酿造工业的发展具有重要的意义［3－4］。孙文瑛等［5］筛选到一株具有耐高温(36℃)、高乙醇(11%)的醋酸菌，经优化后其醋酸产量达到48．6 g/L。邵建宁等［6］通过紫外线、硫酸二乙酯逐级诱变选育得到两株醋酸菌，在培养温度40℃、培养基乙醇浓度12%(V/V)条件下发酵，酒精转化率分别达到70%和75%。

随着生物技术的发展，现已能够利用基因工程的方法构建具有较高醋酸发酵能力的菌株，但从自然界中筛选和诱变选育仍然是食醋发酵菌种选育的首选方法［7－9］。武斌等［10］从山西老陈醋醋醅中筛选出一株巴氏醋杆菌S12，利用N+注入诱变的方法提高该菌株的发酵效率。臧晋等［11］从天然发酵醋醅中分离出高产醋酸菌株，通过氯化锂和紫外线复合处理诱变获得优良的醋酸发酵菌株J11－4。采用酸激复合紫外诱变方法筛选醋酸发酵菌株，发酵结束醋酸浓度达到(84．64±0．24)g/L，转化率达到86．36% ±0．38%［12］。其他常用于醋酸发酵菌株选育的方法还有紫外诱变、微波诱变以及盐酸羟胺等化学诱变的方法［13－15］。

常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)诱变是一种新型诱变育种技术。与其他诱变方法相比，ARTP具有操作简单、安全性高、环境友好、突变速度快、突变率高、突变多样性大等特点［16］。笔者以从山西老陈醋醋醅中筛选获得的一株具有较好耐温特性的巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)WL021为出发菌株，利用ARTP方法进行诱变处理，以提高其发酵效率，为其进一步在醋酸发酵工业的应用奠定基础。

1 材料与方法

1．1 菌种 巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)WL021和巴氏醋杆菌WL021－1，在天津科技大学生物工程学院微生物制药研究室保存。

1．2 培养基 平板培养基组成为葡萄糖15 g/L，酵母膏10 g/L，碳酸钙20 g/L，琼脂 17 g/L，乙醇 3．5%(V/V);种子培养基组成为葡萄糖 20 g/L，酵母膏15 g/L，乙醇3．5%(V/V);发酵培养基组成为葡萄糖20 g/L，酵母膏15 g/L，乙醇7．0%(V/V)、乙酸 1．0%(V/V)。

1．3 醋酸发酵方法

1．3．1 种子液制备。在种子培养基(250 ml摇瓶，40 ml装液量)中接入醋酸菌，培养温度为35℃，摇床转速为180 r/min，培养27 h左右。

1．3．2 摇瓶发酵。在发酵培养基(500 ml摇瓶，100 ml装液量)中，按10%的接种量接入醋酸菌种子液，在发酵温度35℃、摇床转速180 r/min的条件下进行发酵，待发酵液中乙醇浓度低于0．5%时，发酵结束。

1．3．3 发酵罐发酵。按10%的接种量将二级种子培养液接入发酵罐中(15 L发酵罐，10 L装液量)，控制发酵温度为前期35℃，通风量控制为0．15 vvm，连续2次测定酸度未上升，发酵结束。

1．4 耐温醋酸菌的筛选 在超净台上，取10 g醋醅样品，置于含有90 ml发酵培养基的三角瓶中，在40℃、180 r/min条件下培养3 d。吸取培养液1 ml，利用无菌生理盐水适当稀释后涂布于固体平板培养基，挑单菌落划线于新的平板中，两次分离、纯化后获得纯菌株。

1．5 醋酸菌的鉴定 挑取平板上的醋酸菌于种子培养基中，40℃培养2 d后利用细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取基因组。以提取出的基因组为模板，选用细菌通用上下游引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCA)、1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)，扩增 16SrDNA 片段，反应条件为:95℃预变性5 min，然后经30个循环(95℃30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s)，最后 72 ℃延伸 8 min。浓度1．5%琼脂糖凝胶电泳切胶纯化回收条带，送华大基因公司测序，将测序序列进行BLAST比对。

1．6 醋酸菌WL021最适发酵温度优化 按10%接种量向发酵培养基中接入巴氏醋杆菌WL021种子液，培养温度分别为30、35、40、45 ℃，摇床转速为 180 r/min，当酸度不再增加时发酵结束，确定最佳的发酵温度。

1．7 ARTP诱变及菌株选育

1．7．1 ARTP诱变时间的确定。将巴氏醋杆菌WL021接种于种子培养基，培养至对数中期，发酵液4 000 r/min离心10 min，菌体用生理盐水(0．85%)洗涤2遍后重悬，备用。

使用ARTP等离子体诱变仪，工作气体为高纯氦气，取7份10μl上述菌悬液于载玻片上进行诱变处理。仪器输出功率120 W，辐照距离2 mm，气流量10 SLM，处理时间分别为0、15、20、25、30、35、40、45 s。将处理后的菌液适当稀释后涂布，35℃下培养，计算致死率。每个梯度设3个平行。

1．7．2 诱变菌株的初筛。将诱变处理后的菌液涂布于平板培养基上，35℃下倒置培养48 h，随机挑选单菌落点接到含碳酸钙的平板培养基上，点接原始菌为对照，35℃下培养48 h，选取相对原始菌HC(透明圈直径/菌落直径)大的菌株为初筛突变株。

1．7．3 诱变菌株摇瓶复筛。按10%的接种量向发酵培养基中接入醋酸菌(500 ml摇瓶，100 ml装液量)，在35℃、摇床转速180 r/min的条件下发酵48 h，选取具有较高发酵效率的菌株进行后续试验。

1．8 分析方法 采用滴定法测定总酸浓度，以酚酞为指示剂，用0．1 mol/L氢氧化钠溶液将发酵液滴定至粉红色，计算总酸浓度。

2 结果与分析

2．1 醋酸菌WL021的分离、纯化与鉴定 从山西老陈醋醋醅中分离、纯化获得一株能够在40℃条件下生长且能够利用乙醇产生透明圈的的醋酸菌，命名为WL021。其菌落菌体形态如图1所示。菌落形态为圆形，白色，凸起;显微镜观察菌体形态为短杆状，成串或单个存在，革兰氏染色呈阴性。利用PCR方法扩增菌株WL021的16SrDNA送华大基因公司测序，将该菌株序列16SrDNA输入Genbank进行Blast序列比对，结果表明它与Acetobacter pasteurianus(GenBamk ID:AB680032．1)的同源性为99%。

2．2 巴氏醋杆菌WL021最适发酵温度 温度对醋酸菌生长和醋酸发酵有很大的影响。虽然巴氏醋杆菌WL021是在40℃条件下筛选出来的，但仍需要对其最适生长和醋酸发酵温度进行研究。由图2可知，发酵24 h后巴氏醋杆菌WL021进入快速产酸阶段，35℃下菌体生长和产酸速率最快。目前生产上常用的醋酸菌(如AS1．41、沪酿1．01)发酵温度一般均为30℃。巴氏醋杆菌WL021具有较好的耐热性，可耐受40℃温度，但其最适的醋酸发酵温度为35℃。在此温度下醋酸发酵不仅具有较高的发酵效率，并且有利于减少发酵罐冷却成本。为了提高该菌株的发酵效率，采用ARTP的方法对其进行诱变选育。

2．3 ARTP诱变选育醋酸菌

2．3．1 ARTP诱变时间的确定。选择对数中期作为菌种的较适诱变时期，将活化的巴氏醋杆菌WL021在种子培养基中培养约20 h时进行诱变处理。诱变时间对致死率的影响如图3所示。进一步试验选取的诱变处理时间为25 s。

2．3．2 诱变菌株的筛选。利用ARTP诱变仪对巴氏醋杆菌WL021进行诱变处理，诱变时间为25 s。随机挑选诱变后的菌落100个。根据透明圈出现的时间和HC大小(表1)，初步选择7株突变菌进行进一步试验。

在摇瓶中利用发酵培养基对筛选出的7株诱变菌株和出发菌株进行醋酸发酵。由表1可知，摇瓶发酵48 h后，7株诱变株产酸量均高于出发菌株，其中诱变株WL021-1产酸量达54．29±3．40 g/L，与出发菌株相比提高约50%。将巴氏醋杆菌WL021-1在斜面培养基上连续传代10次后其醋酸

表1 菌株HC值和发酵产酸比较

2．4 发酵罐醋酸发酵稳定性试验 利用巴氏醋杆菌WL021-1在15 L发酵罐中分别进行3批醋酸发酵。发酵温度为35℃，发酵初始乙醇浓度为7%，初始醋酸浓度为10g/ml，每分钟通气量为0．15 vvm，连续2次测定，发现酸度未上升，结束发酵。由表2可知，与出发菌株相比，巴氏醋杆菌WL021-1醋酸发酵的产酸量和酒精转化率没有明显差异，但发酵周期缩短，发酵效率提高约10%。该菌株三批次醋酸发酵过程中发酵周期和产酸基本稳定，酒精转化率大于90%，说明该菌株具有潜在的工业应用价值。

表2 巴氏醋杆菌WL021-1醋酸发酵稳定性试验

3 结论

从山西老陈醋醋醅中筛选获得能够在40℃条件下生长的醋酸菌WL021。16SrDNA序列分析结果表明，该菌株属于巴氏醋杆菌。该菌株最适的生长和醋酸发酵温度为35℃。利用常温等离子诱变的方法对菌株WL021进行诱变处理，选育获得35℃条件下具有较高醋酸发酵效率的菌株WL021-1。利用15 L自吸式发酵罐，进行巴氏醋杆菌WL021-1醋酸发酵试验。在发酵初始乙醇浓度7%，初始醋酸浓度10 g/ml，35℃，通气量0．15 vvm条件下，巴氏醋杆菌WL021-1平均发酵周期为59 h，终酸浓度为74．9 g/ml，乙醇转化率约为93%，平均发酵效率为1．10 g/(ml·h)，与出发菌株相比发酵效率提高约10%。

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