柴胡中草药对奶牛瘤胃菌群多样性及纤维分解菌的影响

潘 龙，卜登攀*，王加启，程建波，孙先枝，王秀敏，秦俊杰，袁耀明，张幸开

（1．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京100193；2．北京生泰尔生物科技有限公司，北京102206；3．上海光明荷斯坦牧业有限公司，上海200436）

柴胡中草药对奶牛瘤胃菌群多样性及纤维分解菌的影响

潘 龙1，卜登攀1*，王加启1，程建波1，孙先枝1，王秀敏2，秦俊杰2，袁耀明3，张幸开3

（1．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京100193；2．北京生泰尔生物科技有限公司，北京102206；3．上海光明荷斯坦牧业有限公司，上海200436）

通过DGGE和RT—PCR技术研究日粮中添加不同剂量的柴胡中草药对奶牛瘤胃细菌多样性和主要纤维分解菌（琥珀酸丝状杆菌、黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌）的影响。根据产奶量（37．5±1．8）kg／d、泌乳天数（75±15）d以及胎次（1．7±0．4）等相近的原则，将40头健康的中国荷斯坦泌乳奶牛随机分为4组（n＝10），分别饲喂4种不同的处理日粮，即在基础日粮中分别添加0，0．25，0．50和1．00 g／kg的柴胡中草药（DM基础）。试验持续10周，并在第6周口腔采集瘤胃液，通过变性梯度凝胶电泳（DGGE）和实时定量PCR（RT—PCR）对瘤胃细菌进行分析。DGGE图谱显示，中草药添加组和空白对照组并没有显著的差异条带，但其指纹图谱相似性并不高，均低于0．54，且1．00 g／kg的添加量显著降低了瘤胃液细菌香农多样性指数，而0．50和1．00 g／kg的添加量则提高了菌群优势度指数（P＜0．05）；RT—PCR结果显示，柴胡中草药对奶牛瘤胃主要纤维分解菌并没有显著的影响。因此，柴胡中草药在一定程度上影响了瘤胃细菌的多样性，但差异并不显著，可能由于瘤胃微生物适应了柴胡中草药的添加。

柴胡中草药；奶牛；细菌多样性；纤维分解菌

日粮或营养因素是调控奶牛瘤胃发酵的有效措施［1］。然而，中草药及其提取物调节瘤胃发酵越来越受到关注［2］。黄芪（Leguminosae）根和多糖的添加可以提高瘤胃丙酸含量，改变瘤胃发酵模式［3］；山楂（Crataegus pinnatifida）和黄芩（Scutellaria prostrata）等复方中草药可以改善瘤胃发酵功能，并促进乳酸杆菌和淀粉分解菌数量增加［4］；蓝蓟（Echium vulgare）属提取物可以提高瘤胃微生物蛋白合成及降低原虫数量，从而调控瘤胃发酵［5］；凤仙花（l mpatiens divaricata）明显降低甲烷生成，促进氨态氮（NH3-N）向微生物蛋白（MCP）转化，改变了瘤胃代谢模式［6］等。目前，虽然中草药及其提取物逐渐被开发利用于调控奶牛的瘤胃发酵，但是可以代替饲料添加剂利用的中草药并不是很多［7］；因此，寻求有效调节瘤胃微生态的新型中草药备受期待［8］。

柴胡（Bupleurum chinensis）是传统中药，含有丰富的化学成分，包括柴胡皂苷、挥发油和多糖等［9-11］，具有解热退烧、镇静安神、抗炎抗病毒、提高免疫力等多种生物活性［12-13］，因此，具有很高的营养和药用双重价值［14］。现代药理学证明，柴胡对人工发热的家兔有显著的解热作用［15］，其有效成分为挥发油和皂苷［16］，且柴胡皂苷不仅能使发烧的动物降温，而且口服大剂量皂苷（200～800 mg／kg），也能使大鼠正常体温下降［17］；此外，柴胡皂苷和挥发油也有显著的抗炎作用和免疫调节功能［18］。临床上，柴胡具有良好的降温退烧效果，常用于治疗感冒和发烧导致的体温升高［19］。柴胡解热是多方面综合的原因，包括抗菌抗病毒，增强抵抗力；扩张皮肤血管增加散热、促使血液流向体表加强蒸发散热等［20］。目前，柴胡中草药应用于畜牧生产不是很多，但从其药用和营养的双重作用来看，其应用于缓解畜禽热应激和提高机体免疫力有着广泛的应用前景［21］。

本课题已研究表明柴胡中草药可以缓解奶牛热应激，提高夏季奶牛的产奶量［22］；但柴胡中草药能否通过影响瘤胃菌群的变化而调控瘤胃发酵，目前暂没有报道。因此，该试验研究柴胡中草药对奶牛瘤胃细菌多样性及纤维分解菌的影响，为柴胡中草药进一步应用于缓解奶牛热应激提供参考依据。

1 材料与方法

1．1 试验地点与材料

2012年6—9月在上海光明荷斯坦牧业有限公司—胡桥奶牛场进行饲养试验；2013年5—8月在实验室进行样品分析。柴胡中草药为柴胡根，主要成分为皂苷和挥发油等，来源于北京生态尔生物科技有限公司。

1．2 试验设计与管理

根据产奶量（37．5±1．8）kg／d、泌乳天数（75±15）d以及胎次（1．7±0．4）等相近的原则将40头健康的荷斯坦奶牛随机分为4组（n＝10），分别饲喂4种不同处理日粮，即在基础日粮中分别添加0，0．25，0．50，1．00 g／kg的柴胡中草药（DM基础），试验基础日粮的组成参照奶牛营养需要（2001）推荐标准，满足奶牛营养需要（表1）。试验牛只饲喂基础日粮1周（预饲期），然后饲喂相应处理日粮9周（正饲期），共持续10周。试验牛群采用传统的先粗料后精料的栓系式饲养，每天饲喂3次，自由饮水，挤奶3次。

1．3 样品采集与制备

1．3．1 瘤胃液样品采集与制备 在试验第6周奶牛饲喂后2 h左右，通过口腔采样器采集瘤胃液200 m L，采集时弃掉最先采集的200 m L瘤胃液，采集样品后用4层纱布过滤，然后分装至10 m L离心管，—20℃冻存备用。

1．3．2 DNA提取与16S r DNA V3区域PCR扩增 采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）结合珠磨法提取DNA［23］；16S r DNA V3区域PCR扩增体系50μL：1μL模板DNA，25μL 2×HiFi Taq Star Mix（GenStar），1μL 533r／GC-338f（GC-338f：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAG GCAGCA；533r：TTACCGCGGCTGCTGGCAC），剩余体积用dd H2O补齐。

1．3．3 变性梯度凝胶电泳（DGGE） DGGE采用Dcode突变检测系统（Bio-Rad）进行［24］，其中聚丙烯酰胺浓度为8%，尿素浓度范围为50%～65%；恒定电压85 V，60℃条件下电泳14 h；采用银染法染色，用Umax扫描仪（GS-800，Bio-Rad）扫描凝胶；扫描图谱用Quantity-One（Bio-Rad）软件进行聚类分析。

1．3．4 RT—PCR引物与扩增程序 标准品与引物均为本实验室课题组先前制备的冻存样品［25］；利用引物和标准品在ABI 7500 Real-Time PCR System上进行qPCR绝对定量。

1．4 数据处理与统计分析

基于DGGE图谱分析结果［26］，根据公式H＝—∑［Piln（Pi）］；C＝∑（Pi）2。其中，H代表香浓指数（Shannon—Weiner Index），Pi＝ni／n，ni代表第i个条带的光密度峰值，n代表泳道中所有条带的光密度峰值之和，C代表优势度指数。分别计算处理组样品的香浓多样性指数和优势度指数；绝对定量的数据通过对数转换后，采用广义线性（GLM）模型（SAS 9．2）进行方差分析。

2 结果与分析

2．1 细菌多样性研究

2．1．1 DGGE指纹图谱 DGGE图谱中每一个条带代表一种细菌且各泳道相同位置的条带代表同一种细菌，条带的亮度越大反应该细菌的数量越多。从DGGE图谱（图1）可以看出每个处理组均含有丰富的电泳条带，直观反映了瘤胃细菌的多样性；条带数量虽然没有显著的变化，但是颜色深浅却稍有差异，如：条带a和b在空白对照组清晰明显，但在柴胡添加组却模糊不清；条带c和d在空白对照组颜色暗淡，但在柴胡添加组，尤其是0．5和1．0 g／kg的剂量组却清晰明显。因此，柴胡中草药没有显著导致条带的差异，但是在某种程度上却引起了菌群的变化。

2．1．2 聚类分析 将DGGE电泳图谱通过Quantity-One软件进行处理并比较各个泳道之间的相似性，进行非加权组平均法（UPGAMA）聚类分析。每个处理组内相似性较高，均达到50%以上；而柴胡添加组，尤其是0．5和1．0 g／kg的剂量组与对照组相似性较差，相似性低于42%（图2）。因此，聚类分析进一步说明柴胡中草药对瘤胃微生物具有一定的影响。

2．1．3 瘤胃细菌多样性分析 通过Quantity One软件输出的光强度数据计算细菌多样性指数和优势度指数，并通过SAS 9．2进行单因素方差统计分析。柴胡的添加有降低细菌多样性指数的趋势，且1．00 g／kg的添加量显著降低了细菌多样性指数（P＜0．05）；但是0．5和1．0 g／kg的添加量显著提高了菌群优势度指数（P＜0．05）。因此，1．0 g／kg的柴胡中草药降低了细菌多样性指数，却增加菌群优势度指数，即细菌的种类可能减少，但是优势菌的数量却增加（图3）。

2．2 纤维分解菌分析

柴胡中草药并没有显著增加（P＞0．05）单位瘤胃液中主要纤维降解菌的拷贝数（表2）。因此，柴胡中草药对瘤胃液中主要的3种纤维降解菌没有显著的影响。

3 讨论

植物次级代谢产物可以通过改变细胞膜的通透性，从而引起细胞质中离子流失，导致细胞死亡［27］；这主要取决于植物的种类及其主要的活性次级代谢产物［2］。柴胡根含有丰富的次级代谢产物，其中最主要的就是皂苷，约占干物质的7%［18］。皂苷在瘤胃中被水解成皂苷元，氧化后，在十二指肠和空肠等被吸收，然后通过胆汁以结合或者游离的皂苷元分泌出去［28］。然而，由于皂苷在瘤胃中与微生物相互作用，因此皂苷作用较为复杂［6］。一方面，皂苷可以选择性影响瘤胃微生物［29］；另一方面，皂苷可以被微生物降解成皂苷元［30］。研究表明，瘤胃中的皂苷生物活性比皂苷元高，因此瘤胃微生物将皂苷去糖基化将降低皂苷的抗微生物活性［31］。

低剂量皂苷（0．2 g／L）可以选择性刺激细菌生长，可能由于增加了细胞膜的通透性，从而增加了细菌细胞的营养吸收；而高剂量皂苷（0．6 g／L）可以抑制细菌的生长，这可能与抑制原虫的数量与活力有关［32］。关于皂苷对瘤胃微生物的研究效果也报道各异，茶皂苷（0．4 g／L）显著降低了瘤胃真菌的数量，但并没有影响黄色瘤胃球菌［33］；皂树苷和丝兰皂苷（0～0．6 g／L）对白色瘤胃球菌的丰富度没有显著影响，但皂树苷降低了黄色瘤胃球菌，而丝兰皂苷却增加了黄色瘤胃球菌的丰富度［31］；无患子皂苷对瘤胃纤维降解菌的影响却不相一致，或降低［34］、或升高［35］、或没有显著影响［36］。然而，该试验中，柴胡中草药的添加并没有显著改变瘤胃微生物的种类，对主要的纤维分解菌也没有显著影响，但是较高剂量（0．5和1．0 g／kg）的中草药提高了优势菌的数量，这与其他研究结果不甚一致，可能与皂苷的种类及其微生物降解有关。进一步研究表明，无患子皂苷对绵羊和山羊瘤胃中白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌的负面效应并不是长久有效，当饲喂到105 d时抑制效应消失，也许由于微生物适应了皂苷的添加［35］。因此，这也从侧面反映了为什么皂苷对微生物的影响结论不尽一致。

体外研究苜蓿皂苷对纤维菌的影响，持续作用14 h后白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌的数量并没有减少，但是活性显著降低［37］；因此，并不能根据某些纤维菌的数量简单判断皂苷对微生物的影响，因为纤维菌的活性与数量相关性并不是很高［38］。因而，本试验只能表明柴胡对3种主要纤维降解菌的数量没有显著影响，但是否影响其活性仍有待进一步研究。

挥发油可以短时间抑制原虫和真菌的生长［8］，也可以通过选择性作用于特定瘤胃微生物，尤其是蛋白质和淀粉分解菌［7］，从而调控瘤胃发酵。挥发油可以短期抑制细菌的生长［27］，改变瘤胃菌群的多样性［39］，但对总菌活性没有显著影响［40］。然而，挥发油作用时间过长也容易导致微生物的适用，降低应用效果［7］。因此，不管是挥发油还是皂苷作用时间过长，均会引起瘤胃微生物的适应，从而导致试验效果不尽一致，从而也增加了提取物开发利用的难度。

本试验中的结果与研究报道不完全相同，这种差异可能由于皂苷在瘤胃中被微生物降解产生的皂苷元类型和剂量等不同导致，同时发挥生物活性的有效成分也仍不确定，是否具有皂苷和皂苷元协同作用仍旧是个未知数［32］。然而，这些因素在瘤胃灰箱中无法控制，这也许就是中草药及提取物的一大综合治理的特色。当然，中草药及其提取物的药效也与植物自身生长因素有关，比如光周期、植物生理、环境因素以及加工等过程有关；另一方面也可能是试验周期过长，瘤胃微生物已经适应了皂苷和挥发油等次级代谢产物的环境，从而使应用效果不显著［41］。因此，中草药调节瘤胃微生态环境是多种因素的结果，不但与中草药的植物化学有关，而且与瘤胃中微生物有关，并且它们之间也存在着复杂的相互关系；这也就是为什么中草药调节瘤胃微生物代谢的结果不尽一致，同时也因此增加了中草药的研究难度。

4 结论

柴胡中草药并没有影响主要纤维分解菌的数量，也没有导致条带的差异性变化，但是其指纹图谱与对照组相似性并不高，且1．0 g／kg的添加量显著降低了瘤胃液香农多样性指数，而0．5和1．0 g／kg的添加量则提高了菌群优势度指数。因此，柴胡中草药在一定程度上影响了瘤胃细菌的多样性，但差异并不十分显著，可能由于瘤胃微生物适应了外源性柴胡中草药的添加。

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Effects of radix bupleuri herbal supplementation on bacterial community diversity in the rumen of lactating dairy cows

PAN Long1，BU Dengpan1*，WANG Jiaqi1，CHENG Jianbo1，SUN Xianzhi1，WANG Xiumin2，QIN Junjie2，YUAN Yaoming3，ZHANG Xingkai3
1．State Key Laboratory of Animal Nutrition，lnstitute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；2．Beijing Centre Biology Co．，Ltd．，Beijing 102206，China；3．Shanghai Bright Hostan Co．，Ltd．，Shanghai 200436，China

This experiment was conducted to investigate the effect of radix bupleuri（Bupleurum chinensis）herbal supplementation（RBH）on the diversity of cellulolytic bacteria including Fibrobacter fuccinogene，Ruminococcus albus and Ruminococcus flavefaciens in the rumen of lactating dairy cows．Forty Holstein cows were randomly assigned to 4 diet groups（n＝10）according to milk yield（37．5±1．8）kg／d and lactation length（75±15）days．Four treatment diets consisted of 0，0．25，0．50 or 1．00 g／kg of RHB dry matter，respectively．The experiment lasted for 10 weeks；rumen fluid samples were collected using a stomach-tube during week 6 ofthe trial．The diversity of the bacterial community in the rumen was assessed using denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）and real-time quantitative polymerase chain reaction（RT—PCR）analysis．The DGGE analysis indicated that there were no differences among the treatment groups．Compared with the control group，the Shannon—Weiner index was significantly reduced（P＜0．05）in the 1．0 g／kg RBH group，while the dominance index was significantly increased（P＜0．05）in the 0．50 and 1．00 g／kg treatments．RT—PCR analysis also showed that RBH had no effect on cellulolytic bacteria．It was concluded that RBH supplementation had little effect on diversity of the bacterial community in the rumen of lactating dairy cows，possibly due to gradual adaptation to the RBH supplementation by rumen bacteria．

radix bupleuri（Bupleurum chinensis）herbal；dairy cow；bacterial diversity；cellulolytic bacteria

10.11686／cyxb20150323 http：／／cyxb.lzu.edu.cn

潘龙，卜登攀，王加启，程建波，孙先枝，王秀敏，秦俊杰，袁耀明，张幸开．柴胡中草药对奶牛瘤胃菌群多样性及纤维分解菌的影响．草业学报，2015，24（3）：219-225．

Pan L，Bu D P，Wang J Q，Cheng J B，Sun X Z，Wang X M，Qiu J J，Yuan Y M，Zhang X K．Effects of radix bupleuri herbal supplementation on bacterial community diversity in the rumen of lactating dairy cows．Acta Prataculturae Sinica，2015，24（3）：219-225．

2014-02-28；改回日期：2014-04-21

“十二五”科技支撑计划（2012BAD12B02-5）和中国农业科学院科技创新工程（ASTIP-IAS07）资助。

潘龙（1988-），男，江苏邳州人，在读硕士。E-mail：panlong8809＠163．com

*通讯作者Corresponding author．E-mail：burdenpan＠gmail．com