维生素C与过氧化氢对老年豚鼠耳蜗外毛细胞大电导钙激活钾通道电流的影响△

赖丹黄非覃纲

·实验研究·

维生素C与过氧化氢对老年豚鼠耳蜗外毛细胞大电导钙激活钾通道电流的影响△

赖丹1黄非2覃纲1

目的 研究过氧化氢（H2O2）及维生素C对老年豚鼠耳蜗外毛细胞大电导钙激活钾通道（large conductance Ca2+-activated potassium channels，BKCa channels）电流的影响及其机制。方法 采用急性酶分离方法分离25只老年豚鼠耳蜗外毛细胞，以膜片钳全细胞记录方式观察BKCa通道电流（5只豚鼠）；记录到稳定、正常的BKCa通道电流后，向新鲜分离贴壁外毛细胞的2 ml浴槽的浴液中加入H2O2稀释液40μl，使浴液中H2O2浓度为4μmol／L，观察H2O2对BKCa通道电流的影响（5只豚鼠）；再分组加入维生素C溶液10、20、40μl（各组5只豚鼠），使浴液中维生素C终浓度分别为25、50、100μg／ml，观察H2O2和维生素C联合作用对BKCa通道电流的影响。结果 ①膜片钳全细胞记录模式下，记录到一串幅值较大、快速激活、几乎不失活的电流，激活电压大于-40～-30 m V，电流随膜电位的增加而增强，并表现出外向整流的特性；加入BKCa通道特异性阻断剂伊比利亚毒素（iberiotoxin，Ib TX）100 nmol／L后，通道活动完全阻断，证实为BKCa通道电流。②加入H2O2后，用药3分钟内，当VT为+50 m V时，BKCa通道峰值电流密度最大值从22.09±0.27 p A／p F升至43.53±1.09 p A／p F，增幅97.06%。H2O24μmol／L+25、50、100μg／ml维生素C时，BKCa通道电流表现浓度依赖性抑制，电流幅值和峰值电流密度随着维生素C浓度增加而减小，I-V曲线下降，洗脱后仍不能恢复至加药前正常水平。结论 老年豚鼠耳蜗外毛细胞存在氧自由基／BKCa途径，而维生素C可减轻氧自由基对外毛细胞BKCa通道的影响。

大电导钙激活钾通道； 外毛细胞； 氧自由基； 维生素C； 过氧化氢

1991年，Atkinson等［1］首次由果蝇中克隆出大电导钙激活钾通道（large conductance Ca2+-activated potassium channels，BKCa channels）。Ca2+与Ca2+结合区结合或电压作用于通道的电压感受器都可引起BKCa通道的激活，因此BKCa通道被胞内Ca2+激活，也被膜电位去极化激活。BKCa通道的特点为：在膜电位-40～-60 m V时激活，激活速度快（0.2～0.4 ms）；单通道电导大（75～250 ps）；被除极电位和胞内Ca2+激活。因其电导大、对Ca2+敏感、电压依赖性及独特的药理特性而区别于其他离子通道。当BKCa通道开放时，K+离子外流，膜电位更负，调制许多重要的生理过程；研究发现，在耳部，BKCa通道和K（v）型钾通道一起参与耳蜗感受器电位的形成［2］，调节耳蜗毛细胞频率发放及神经递质的释放等［3，4］。在听觉形成过程中K+通道发挥着关键作用，故本研究拟通过观察氧自由基供体之一H2O2及抗氧化剂维生素C对老年豚鼠耳蜗外毛细胞大电导钙激活钾通道的影响，探讨是否存在氧自由基／BKCa途径调节外毛细胞乃至内耳的功能，为临床防治老年性聋的研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 实验动物和分组 选用无耳毒性药物接触史、无长期噪声环境暴露史的杂色健康36月龄豚鼠25只（由泸州医学院实验动物中心购买），体重1 000～1 500 g，雌雄不拘。

5只豚鼠用来观察BKCa通道的特性及鉴定，5只用来观察H2O2对BKCa通道的作用（4μmol／L H2O2组，对照组），15只用来观察4μmol／L H2O2和不同浓度维生素C（20、50、100μg／ml）对BKCa通道的作用（每组5只，分别为：4μmol／L H2O2+ 25μg／ml维生素C组、4μmol／L H2O2+50μg／ml维生素C组、4μmol／L H2O2+100μg／ml维生素C组）。

1.2 实验药物及设备 细胞外液（mmol／L）：NaCl 137，KCl 5.4，MgCl21，CaCl21.8，HEPES 10，Glucose 10，NaOH调节PH至7.4。电极液（mmol／L）：NaCl 12，KCl 128，MgCl24，HEPES 10，EGTA（ethylenebis（oxyethylenenitrilo）tertraacetic acid，乙二醇-双（2-氨基乙基）四乙酸0.05，KOH调节PH至7.2。浴液（mmol／L）：NaCl 137，KCl 5.9，MgCl21.2，CaCl21.8，HEPES 10，Glucose 14，NaOH调节PH至7.4。1 mol／L过氧化氢（hydrogen peroxide）：H2O2，国产。维生素C（Vitamin C，Ascorbic Acid）：C6H8O6，国产分析纯。膜片钳放大器（AXOPATCH 200B Axon Instruments，USA），A／D-D／A转换器（Digital-1200 Axon Instruments，USA），离子通道计算机分析系统（Pclamp9.0 Axon instrument，USA）。记忆示波器（VC-11 Nihon Konden，Japan），三通道刺激器（SEN-7203 Nihon konden，Japan）。微管电极拉制器（PP-83 Narishige，Japan），微电极抛光仪（MF-83 Narishige，Japan），三维操纵器（WN203 Narishige，Japan），倒置相差显微镜（IMT -2，Olympus，Japan）。

1.3 豚鼠耳蜗外毛细胞的分离方法 将豚鼠快速断头，取出颞骨听泡，迅速打开听泡，将耳蜗置人已充氧的冷细胞外液中；解剖显微镜下仔细剔除耳蜗骨壳，尽量保持膜迷路完整；断开蜗轴，将去除蜗壳的剩余耳蜗移入含Ⅳ型胶原酶的细胞外液中消化12分钟；然后移入装有浴液并预先用纤维连接纯化蛋白处理底部1小时的浴槽中终止消化。解剖镜下撕碎可见的基底膜组织，轻轻吹打后静置20～30分钟，选择贴壁良好、立体感强、表面光滑、胞核接近底部、胞内无布朗运动颗粒、胞膜完整有双折射现象的单离外毛细胞进行观察和实验。

1.4 BKCa通道电流的记录方法和鉴定方法

1.4.1 BKCa通道电流的记录方法 采用膜片钳全细胞记录模式记录豚鼠耳蜗外毛细胞BKCa通道的活性。选择钳制电压（VH）为-60 m V，以10 m V为一个阶跃，指令电压（VT）从-50 m V起除极至+ 50 m V，刺激持续时间400 ms，激活BKCa通道，记录其电流。记录在屏蔽防震工作台上进行。

1.4.2 BKCa通道电流的鉴定 在上述溶液中，膜片钳全细胞记录方式下记录到稳定的电流后，观察BKCa通道特异性阻断剂伊比利亚毒素（iberiotoxin，Ib TX）对BKCa通道电流的影响，以鉴定是否为BKCa通道电流。

1.5 观察H2O2和维生素C对BKCa通道电流的影响 5只豚鼠的耳蜗外毛细胞用来观察H2O2对BKCa通道的作用。在2 ml浴槽内加入H2O2稀释液40μl，使浴液中的H2O2浓度达到4μmol／L，观察H2O2对BKCa通道的作用；在2 ml浴槽内加入H2O2稀释液40μl，使浴液中的H2O2浓度达到4 μmol／L，再分组加入维生素C液10、20、40μl，使浴液中的维生素C浓度分组达到25、50、100μg／ml（三组，每组5只豚鼠），观察4μmol／L H2O2和不同浓度维生素C对BKCa通道的作用。

1.6 统计学方法 实验记录的电流数据采用PClamp 9.0专用软件进行分析处理。采用电流幅值（current amplitude）、电流密度（current density）、电流-电压关系曲线（I-V curve）作为分析指标，实验数据均以均数±标准差表示。采用SPSS 12.0统计软件对数据进行统计分析，显著性检验采用配对t检验及方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BKCa通道电流的特性 BKCa通道电流为一串幅值较大、快速激活（激活时间约0.2～0.4 ms）、几乎不失活的电流（图1），此外向电流激活电压大于-40～-30 m V，其电流幅度以零电流水平至除极化末之间的电流大小表示。图2示BKCa通道电流-电压（I-V）关系曲线，随着测试电压由-50 m V向+50 m V变化，BKCa电流随膜电位的增加而增强，电流幅值不断增大，并表现出外向整流的特性，记录的电流无“rundown”现象（即随着记录时间的延续，通道电流逐渐降低的现象）。

2.2 BKCa通道电流的鉴定结果 当溶液中加入Ib TX时，外向电流的幅值和峰值电流密度立即明显减小，I-V曲线迅速下降。加入Ib TX浓度达到100 nmol／L时，BKCa通道活动完全阻断，BKCa通道电流消失（图3），证实该外向电流确实是大电导钙激活钾通道电流。

2.3 H2O2对BKCa通道的影响 在H2O2浓度为4μmol／L时，BKCa通道电流比0μmol／L对照组（电流图同图1）表现明显的兴奋，电流幅值和峰值电流密度增大（图4）。用药3分钟内，当VT为+50 m V时，4μmol／L组比对照组从22.09±0.27 p A／p F升至43.53±1.09 p A／p F，增幅为97.06%。

图1 老年豚鼠耳蜗外毛细胞BKCa通道电流

图2 老年豚鼠耳蜗外毛细胞BKCa通道电流-电压曲线（I-V曲线）

图3 使用Ib Tx（100 nmol／L）后的老年豚鼠耳蜗外毛细胞BKCa通道电流

图4 加入H2O2浓度为4μmol／L时的BKCa通道电流

2.4 H2O2、维生素C联合应用对BKCa通道的影响 在H2O2浓度为4μmol／L时，当加入的维生素C浓度分别为25、50、100μg／ml条件下，BKCa通道电流表现为浓度依赖性抑制，电流幅值和峰值电流密度随着维生素C浓度的增加而减小（图5，对照组见图4），I-V曲线下降（图6）。用药3分钟内，当VT为+50mV时，各组对比对照组BKCa通道峰值电流密度最大值见表1，各浓度维生素C+4μmol／LH2O2组与对照组相比，BKCa通道峰值电流密度幅值差异有统计学意义（P＜0.05）；但以上浓度维生素C均不改变BKCa通道的激活电位（-40～-30mV），且洗脱后无法恢复至正常电流水平。

图5 H2O2、维生素C联合应用时老年豚鼠耳蜗外毛细胞BK-Ca通道电流

图6 H2O2、维生素C联合应用对老年豚鼠耳蜗外毛细胞BKCa通道I-V曲线的影响

表1 VT为+50mV时各组耳蜗外毛细胞BKCa通道峰值电流密度幅值（±s）

表1 VT为+50mV时各组耳蜗外毛细胞BKCa通道峰值电流密度幅值（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；△与50μg／ml维生素C+4 μmol／LH2O2组比较，P＜0.05；＃与100μg／ml维生素C+4μmol／LH2O2组比较，P＜0.01

BKCa通道峰值电流增幅组别密度幅值（／）（）PAPF% 4μmol／LH2O2组（对照组）43.53±1.09——25μg／ml维生素C+4μmol／LH2O2组34.85±0.49*△＃-19.94 50μg／ml维生素C+4μmol／LH2O2组30.63±0.56**＃-29.64 100μg／ml维生素C+4μmol／LH2O2组25.79±0.58**-40.75

3 讨论

已有确切证据表明，BKCa通道动力学特性是毛细胞特征频率的决定因素，除产生电调谐外，BKCa通道也参与调节突触部位神经递质释放［5，6］。Langer等［7］发现小鼠内耳毛细胞的听力损失与大、快电导的钾通道的表达一致，认为很可能是BKCa通道调节内耳毛细胞的功能。本实验引出一串快速激活（激活时间约0.2～0.4ms）、幅值较大、几乎不失活的电流，此外向电流激活电压大于-40～-30 mV，随着测试电压由-50mV向+50mV变化，电流随膜电位的增加而增强，电流幅值不断增大，当VT为+50mV时，电流幅值Am达到峰值；I-V关系曲线呈上升型，记录的电流无“rundown”现象，表现出大电导、电压依赖性（通道开放、开放概率和电流幅值以及通道平均开放时间随着膜电位的增加而相应增加，通道平均关闭时间随着膜电位的增加而逐渐减少）、快速激活、钾离子选择性及外向整流的特性，提示可能为BKCa通道电流。

伊比利亚毒素（iberiotoxin，IbTX）是BKCa通道的特异性阻断剂，IbTX对通道的阻断作用呈浓度依赖性。从文中结果看，当溶液中加入IbTX时，外向电流的幅值和峰值电流密度立即明显减小，加入IbTX浓度达到100nmol／L时，通道活动完全阻断，通道电流消失，再次证实本实验记录到的外向电流确实是BKCa通道电流。

本实验结果发现，H2O2对BKCa通道呈浓度依赖性的激活作用，即电流幅值、峰值电流密度增加，提示H2O2产生的外源性氧自由基能够通过作用于BKCa通道蛋白的氨基酸残基，氧化修饰多肽链骨架和侧链，显著改变氨基酸的性质，从而改变整个蛋白质的功能。维生素C可在胞外防止氧自由基损害，捕获包括过氧化作用最强的羟自由基等各种自由基，还有明显提高谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）的作用［8］。维生素C不仅促使双硫基（-S—S -）还原为巯基（-SH），使巯基在体内与其它抗氧化物质一起清除自由基，还能防止维生素A、维生素E以及不饱和脂肪酸的氧化，阻止体内的氧化损伤过程。维生素C作为细胞内抗氧化剂，对与突变、癌变有关的DNA氧化损伤具有重要的保护作用［9］。本实验加入维生素C后，BKCa通道电流表现浓度依赖性的抑制作用，推测维生素C通过捕获包括过氧化作用最强的羟自由基等各种自由基，并明显提高谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性而发挥效应；另外，在洗脱及加入维生素C后BKCa通道电流不能恢复到加药前正常水平，推测氧化作用不能完全迅速消失，或部分H2O2渗透过胞膜进入胞质，从而继续表现出通道激活状态。

现在仍不完全清楚氧化还原剂如何调节BKCa通道活性的机制。BKCa通道中半胱氨酸残基的氧化使整个通道门控活性改变可能如下：接近钙结合区的1个或多个硫氢基（Sulfhydryl）基团被DTNB、标准乙基吗啉（NEM）氧化成二硫化物，负电荷减少而降低与Ca2+的亲和力［10］。氧自由基与其他调节物如蛋白激酶不同，其作用无特异的靶氨基酸，氧自由基大量产生时，加快氨基酸残基的氧化。BKCa通道蛋氨酸残基氧化，将增大BKCa通道活性，促进膜复极化，限制过量Ca2+进入细胞内，抑制神经递质尤其是兴奋性氨基酸的释放，从而保护神经细胞免受损伤［11］。

综上所述，推测当病理条件（如老龄耳蜗缺血再灌注损伤）下，耳蜗氧自由基等代谢产物可大量增加，过量Ca2+进入毛细胞内，造成钙超载现象，从而促使神经细胞的神经递质尤其是兴奋性氨基酸大量释放，造成神经细胞（包括毛细胞）损伤。而此时机体可激活BKCa通道，并通过H2O2／BKCa途径，促进膜复极化，限制过量Ca2+进入细胞内，抑制神经递质释放，避免神经细胞的损伤。氧自由基的细胞毒性可导致细胞死亡、基因突变、染色体畸变等，需要借助内源性抗氧化酶系统和非酶性抗氧化系统来清除，而长期给予外源性的抗氧化剂无疑将增强耳蜗抗氧化的能力，从而有效延缓老年性聋的发病。临床上应用抗氧化剂如维生素C、维生素E、α-硫辛酸预防老年性聋，也有一定的疗效，也支持上述机制存在的可能性。

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8 陈炳卿，主编.营养与食品卫生学［M］.第四版.北京人民卫生出版社，2002.63～66，115～116，130.

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10 Wang ZW，Nara M，Wang YX，et al.Redox regulation of large conductance Ca2+-activated K+channels in smooth muscle cells［J］.J Gen Physiol，1997，110：35.

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（2014-06-30收稿）

（本文编辑 雷培香）

Effects of Vitamin C and Hydrogen Dioxide on the Electric Current of Large-conductance Calcium-activated Potassium Channels in lsolated Outer Hair Cells of Old Guinea Pigs’Cochlears

Lai Dan*，Huang Fei，Qin Gang
（*Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery，The affiliated Hospital of Luzhou Medical College，Luzhou，646000，China）

Objective To study the effects of hydrogen dioxide（oxygen free radical donator）and vitamin C（oxygen free radical scavenger）on the electric current of large conductance calcium-activated potassium channels（BKCa channels）in isolated outer hair cells in aging guinea pigs.Methods Acute enzyme was used to isolat outer hair cells of aging guinea pigs，in which of BKCa channel＇s electric current was observed and recorded by whole-cell recording mode of patch-clamp.After recording the stable and normal electric current of BKCa channels，added H2O2dilution（0.2 mmol／L）40μl in the 2 ml chambers within freshly isolated outer hair cells so that the concentration of H2O2in the balneum would be 4μmol／L.The groups（n＝5）received individually vitamin C solution（5 mg／ml）0，10，20，40μl in the 2 ml chambers within freshly isolated outer hair cells so that the concentration of vitamin C in the balneum would be 0，25，50，100μg／ml，observing and recording the effects of different concentrationof vitamin C to electric current of BKCa channels.Results ①In the whole-cell mode of patch-clamp，the rapid activation and non-deactivation electric current with a string of large amplitude was recorded，above-40～-30 m V activation voltage.The electric current increased with the increasing membrane potential.The amplitude increased continuously and performed characteristics of outward rectification.When the concentration of Ib TX was 100 nmol／L，the activity of the channel was completely blocked and confirmed BKCa channel＇s electric current.②Medication within three minutes，when VTwas+50 m V，the BKCa channels＇the maximum peak current densities of 4μmol／L H2O2group rose from 22.09±0.27 PA／PF to 43.53±1.09 PA／PF，amplification was 97.06%.In H2O24μmol／L+vitamin C with different concentrations as 25，50，100μg／ml groups，the BKCa channels＇electric current performed about concentration-dependent inhibition，and electric current＇s amplitude and peak current density decreased with the increasing concentration of vitamin C，the I-V curves were reduced.However，this still could not be recovered to the normal levels.Conclusion The oxygen free radical／BKCa exists in the process.The vitamin C as oxygen free radical scavenger can reverse the process to a large extent.

Large-conductance calcium-activated potassium channel； Outer hair cell； Oxygen free radical； Vitamin C； H2O2

10.3969／j.issn.1006-7299.2015.02.015

时间：2015-3-3 14：40

R764

A

1006-7299（2015）02-0181-05

△ 四川省卫生厅科学研究项目（130358）资助

1 泸州医学院附属医院耳鼻咽喉-头颈外科（泸州 646000）； 2 宜宾市第一人民耳鼻咽喉科

赖丹，女，四川人，硕士，副教授，主要研究方向为听力学临床与基础。

赖丹（Email：lz_ld@126.com）

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20150303.1440.039.html