教学用兔抗人全免疫血清的制备与效价测定

张淑莉，武永红，张 琪，李素芬

(1.西安医学院医学技术系检验中心 710021；2.陕西省核工业417医院，西安 710600；3.陕西省地方病研究所，西安 710003)



·临床探讨·

教学用兔抗人全免疫血清的制备与效价测定

张淑莉1，武永红1，张 琪2，李素芬3

(1.西安医学院医学技术系检验中心 710021；2.陕西省核工业417医院，西安 710600；3.陕西省地方病研究所，西安 710003)

目的 探讨制备高效价兔抗人免疫血清的方法。方法 将人全血清经弗氏佐剂完全乳化，采用一定的免疫程序免疫家兔，末次加强免疫5 d后收集兔免疫血清，利用双向免疫扩散实验、对流免疫电泳和间接酶联免疫吸附法分别测定血清中抗体的效价。结果 家兔在全程免疫后产生了高效价抗体，效价分别达到了1∶16、1∶8、1∶64 000。结论 用人全血清免疫家兔，可以获得高效价的抗血清，为进一步实验教学和实验研究奠定了基础。

兔抗人免疫血清； 制备； 效价； 教学

用人工免疫的方法，将抗原物质(人全血清)注入动物体(家兔)内，可刺激动物产生特异性抗体，再经多次复种后，抗体的效价明显提高，采集其动物血液，分离析出血清，即为兔抗人免疫血清(抗体)。免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术，动物免疫血清也是在医学教学中，特别是在《临床免疫学与检验》实验教学中，例如沉淀实验、琼脂扩散实验(单向琼脂扩散实验、双向琼脂扩散实验)、免疫电泳实验等经常要用到的试剂，但目前市场购买到的免疫血清价格昂贵，且效价也不高，为保证实验课的教学质量，笔者选取人全血清免疫家兔，以获取较高效价的人全免疫抗血清，并取得了较好效果，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与器材

1.1.1 实验动物 健康雄性家兔6只，由第四军医大学实验动物中心提供，体质量2～3 kg，年龄8个月，无免疫接种史，作好标记后分笼饲养。

1.1.2 主要试剂 弗氏完全佐剂，生理盐水，3%戊巴比妥钠溶液，1.5%琼脂溶液，0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液(pH9.6)，0.05%PBST溶液(pH7.4)，1%牛血清清蛋白(BSA)，酶标二抗(HRP-羊抗兔Ab)，TMB底物溶液(A液，B液)，终止液。

1.1.3 设备与器材 冰箱，离心机，恒温水浴箱，电泳仪，微量加样器，大剪刀(剪兔毛)，止血钳，眼科手术剪(剪动脉血管)，灭菌三角烧瓶，动脉导管，吸管，打孔器，载玻片，湿盒，兔解剖台，三通管，20 mL注射器，纱布，聚苯乙烯微量反应孔等。

1.2 抗原的制备

1.2.1 人全血清抗原 混合健康人血清20份，其中要包括A、B、AB、O所有血型。人全血清乳化前用无菌生理盐水作1∶2稀释共10 mL。

1.2.2 佐剂抗原的制备 取弗氏完全佐剂10 mL，加等体积稀释混合人全血清进行搅拌乳化，即用1个三通管的两端连接2个20 mL注射器，2个注射器分别吸入弗氏完全佐剂和混合血清后，然后来回推注多次，使之成为乳白色黏稠的油包水乳剂。乳化剂的鉴定：将1滴乳化剂滴入冷水中，立刻扩散开，则为未乳化好，如果保持完整不分散，呈滴状悬浮于水面，則为乳化完全。

1.3 免疫途径和程序 初次免疫：选取健康家兔6只，体质量2～3 kg，分别注射制备好的加佐剂的人全血清完全抗原；第1次加强免疫：于基础免疫1周时背部皮内多点注射人全血清(不含佐剂)抗原；第2、3次加强免疫，均为耳缘静脉注射人全血清(不含佐剂)抗原。见表1。

表1 抗人全血清免疫程序

1.4 试血 在末次免疫后第5天试血，用无菌注射器在家兔耳缘静脉采血1 mL,分离血清，37 ℃温育1 h，以3 000 r/min离心20 min，吸取上清置于F管中，初步测定双向免疫扩散实验测效价大于1∶16时，即可收获血清。

1.5 采集免疫血清 将兔子称重，以3%浓度的戊巴比妥钠溶液，按每公斤体质量30 mg剂量在耳缘静脉推注麻醉药，应一边注射一边注意观察每只兔子眼睑反射、瞳孔和呼吸的变化，麻醉好后将免疫家兔仰面固定于兔解剖台上，头部放低，暴露颈部。剃毛并消毒皮肤。沿颈部中线用手术刀切开皮肤约10 cm，沿气管钝性分离皮下组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌，轻轻分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，可见淡红色搏动的颈动脉并作钝性分离，小心将颈动脉和迷走神经剥离长约5 cm，于一侧动脉分别套入两根细线，一根在远心端，一根在近心端。远心端用细线结扎，近心端用动脉夹夹住动脉，注意勿损伤血管，用眼科小剪刀在近心端动脉壁上剪一“v”形缺口，将事先用肝素浸泡的无菌动脉导管一端插入近心端动脉中并固定，动脉导管另一端放入灭菌三角烧瓶中，然后缓缓松开动脉夹，血液很快射入到灭菌三角烧瓶中。将三角烧瓶中的血液置于37 ℃，并做好标记，1 h后置于冰箱4 ℃过夜，待血块自然收缩后分离血清，分装冻存保存备用。

1.6 检测兔免疫血清效价

1.6.1 双向琼脂扩散实验测定抗血清效价 取一块干净的玻片，将已融化的琼脂(1.5%)溶液5 mL，缓慢地平铺在玻片上，使琼脂厚度约1.5 mm，待琼脂凝固后，用打孔器打孔(孔径3 mm，孔间距10 mm)，呈梅花形，挑去孔内琼脂，用移液器加样，中心孔加抗原原液约20 μL，周围各孔按顺序依次加入20 μL倍比稀释抗血清，抗体分别是原液,1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，注意加样时(孔加满为止)不要外溢，不要有气泡。加完样后将载玻片置于湿盒内，放入恒温箱37 ℃、扩散24 h，观察有无沉淀线产生，以出现明显沉淀线(++)的最高稀释度作为检测血清效价。

1.6.2 对流免疫电泳实验测定抗血清效价 以pH8.6离子强度0.05 mol/L巴比妥缓冲液配成1.5%琼脂凝胶板，厚度1.5 mm。琼脂凝固后，用打孔器成对的打孔，孔径3 mm，孔间距3 mm，排距8 mm。挑去孔内琼脂，封底。加样时一对孔中，一孔加已知抗原，另一孔加待测抗体(做系列倍比稀释分别是原液，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32)，电泳时将抗原端接负极侧，抗体端接正极侧，在电场中电泳50 min(6 V/cm)后观察结果。

1.6.3 间接酶联免疫吸附法鉴定血清效价 (1)用包被缓冲液将抗原(新鲜人全血清)作1∶100稀释，取12个反应孔，酶标板各孔中加稀释抗原200 μL，放置4 ℃过夜。第2天弃去孔中液体，PBST洗涤3次。(2)各孔加入1%BSA 100 μL，放置4 ℃封闭过夜，甩干，PBST洗涤3次。(3)各孔分别依次加入倍比稀释的待测兔抗血清100 μL(1∶500，1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，1∶16 000，1∶32 000，1∶64 000，1∶128 000)，37 ℃温箱孵育1 h，PBST洗涤5次。(4)每孔加入100 μL(1∶1 500稀释)的HRP-羊抗兔IgG，同上孵育及洗涤。(5)每孔加入底物溶液100 μL,室温避光静置10 min后，每孔加入终止液50 μL,目测观察结果。以上方法均设有2个阴性对照、1个空白对照。以阳性反应的最高稀释倍数作为免疫血清的效价。

2 结 果

2.1 双向免疫扩散法鉴定结果 取琼脂板在黑色背景上观察抗原抗体孔在1∶16血清稀释处出现清晰的白色沉淀线，所以沉淀线的最高血清稀释倍数为1∶16，证明该动物易产生特异性抗体，兔抗血清效价为1∶16，表示免疫成功。

2.2 对流免疫电泳法测定结果 对流免疫电泳结果显示在1∶8时形成一条清晰可见沉淀线。

2.3 间接酶联免疫吸附法测定血清效价结果 在酶联免疫吸附法中，随着低稀释度到高稀释度的逐渐增大，孔内的蓝色由深逐渐变浅，为阳性反应，并且呈现一定的梯度性，而2个阴性对照孔和空白对照孔没有颜色显示，为阴性结果，通过目测，免疫血清抗体的效价达到1∶64 000。

3 讨 论

3.1 《临床免疫学与检验》作为医学检验专业的主干课程，对培养检验医学人才至关重要[1-2]。实验教学是教学工作的重要组成部分，以培养学生临床操作能力、理论联系实际、分析解决问题的能力和科学思维方法为目的，对实现素质教育和培养创新人才具有重要意义[3]。

3.2 用双向扩散试验检测抗体时，此法重复性好，操作简便，不需要特别仪器设备，但灵敏度不够高，可以用对流免疫电泳试验来替代抗体的检测，提高效率与灵敏度[4-5]。对流免疫电泳由于电场的作用，限制了抗原、抗体的自由扩散，从而使其定向泳动，因而增加了试验的灵敏度，并缩短了反应时间。酶联免疫吸附法实验灵敏度高，特异性好，在临床上得到广泛应用[6]。但是在操作中各环节对检测效果影响较大，如抗原抗体的包被浓度、待测抗体的浓度、酶结合物浓度及试剂的质量控制等，都将会影响检测结果。

3.3 本次实验使用的人全血清作为可溶性抗原，在首次注射时加入了佐剂，使得抗原的免疫原性加强，避免了免疫耐受，本实验在1个月内制备出较高效价的兔抗人免疫血清，具有免疫时间短、所产生兔抗人免疫血清效价高等特点，与文献[7-10]报道比较一致。将收集的抗血清应用于免疫学沉淀反应实验教学中，发现所得的抗血清出现的沉淀反应效果明显,从实验结果看, 用人全血清免疫家兔，可以获得高效价的抗血清，为进一步实验教学和实验研究奠定了基础。

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西安医学院校级科研基金大学生科研项目(11DXS11)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.15.056

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1672-9455(2015)15-2267-03

2015-02-15

2015-03-28)