35株多重耐药嗜麦芽窄食单胞菌的β-内酰胺酶耐药基因分布研究*

罗卉丽，陈姗姗，杨宏伟，赵 颖，昌睿杰△

(1.湖北省十堰市妇女儿童医院 442000；2.湖北省十堰市太和医院 442000)



·论 著·

35株多重耐药嗜麦芽窄食单胞菌的β-内酰胺酶耐药基因分布研究*

罗卉丽1，陈姗姗1，杨宏伟2，赵 颖2，昌睿杰2△

(1.湖北省十堰市妇女儿童医院 442000；2.湖北省十堰市太和医院 442000)

目的 对十堰地区2014年分离的35株多重耐药嗜麦芽窄食单胞菌(SMA)进行耐药表型、耐药基因研究。方法 收集十堰地区2014年分离的35株多重耐药SMA，采用纸片扩散法检测细菌耐药性。超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)采用标准纸片法检测，头孢菌素酶(AmpC)和金属β-内酰胺酶(MBLs)检测采用三维试验，非金属碳青霉烯酶(KPC)检测采用改良Hodge试验。采用PCR法检测细菌耐药基因,对阳性结果进行基因正、反向测序分析。结果 35株多重耐药SMA中，ESBLs、AmpC、MBLs、KPC阳性率分别为45.7%、14.3%、94.3%、0.0%。耐药基因blaTEM、blaSHV、blaCARB、blaIMP、blaOXA-10、oprD2的阳性率分别为22.8%(8/35)、11.4%(4/35)、17.1%(6/35)、94.3%(33/35)、8.6%(3/35)、28.5%(10/35)。结论 该地区的多重耐药SMA对碳青霉烯类抗菌药物的耐药状况非常严重，应引起重视。

医院感染； 多重耐药嗜麦芽窄食单胞菌； β-内酰胺酶； 耐药基因

嗜麦芽窄食单胞菌(SMA)是广泛分布于自然界的条件致病菌，也是医院感染最常见的病原菌之一。近10年来，SMA在医院感染导致死亡的流行病菌中所占的比例越来越高[1]。广州呼吸疾病研究所2003～2007年从下呼吸道分离的1 709株革兰阴性菌中，SMA占9.2%，占调查分离菌的第3位[2]；吴明芝等[3]报道在儿科临床标本中，SMA阳性率为4.6%，在革兰阴性杆菌中位居第4。中国CHINET细菌耐药性监测网的数据表明，SMA有较高的耐药率[4]。本研究旨在调查2014年十堰地区分离的35株多重耐药SMA的耐药基因分布情况，为指导临床合理使用抗菌药物，减少SMA耐药菌株的暴发流行及传播奠定理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2014年分离自十堰市太和医院和十堰市妇幼保健院患者血液标本的多重耐药SMA，共35株，对于同一患者血液分离的重复菌株则选取第1次分离的菌株。

1.2 仪器与试剂 DLMedcal-96Ⅱ全自动细菌鉴定系统(迪尔医学)；PE9600型DNA扩增仪(美国PE公司)；电脑三恒多用电泳仪DYY-12电泳仪(北京六一仪器厂)；BacT/ALERT®3D血培养仪(法国梅里埃公司)；G-BOX全自动凝胶成像系统(Syngene公司)；3730型全自动基因测序仪(美国ABI公司)。DL-96E细菌测定系统随机体外诊断试剂板(珠海迪尔医学公司)；细菌微量生化反应管(杭州天和微生物试剂公司)；PCR Master Mix试剂(美国Promega公司)；抗菌药物纸片(英国Oxoid公司)。基因blaTEM-1、blaSHV、blaCARB-2、blaIMP、blaOXA-10、oprD2、blaKPC、blaPER、blaVEB、blaGES、blaVIM、blaSPM、blaGIM、blaDHA、blaOXA-1、blaOXA-2所用引物设计参考文献[5-7]，由上海生工生物工程技术有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 细菌鉴定和药敏试验 血培养采用BacT/ALERT 3D血培养仪，细菌鉴定采用DLMedcal-96Ⅱ全自动细菌鉴定系统完成，药敏试验采用纸片扩散法进行。

1.3.2 耐药表型检测 分别进行β-内酰胺酶的提取及检测，包括：超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)检测(标准纸片法)、头孢菌素酶(AmpC)检测(三维试验)、金属β-内酰胺酶(MBLs)检测(三维试验)、非金属碳青霉烯酶(KPC)检测(改良Hodge试验)。

1.3.3 耐药基因检测 各种靶基因PCR扩增体系均使用Promega的PCR Master Mix试剂，总体积25 μL。PCR反应条件：94 ℃，2 min，1个循环；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；72 ℃延伸7 min，1个循环。将产物进行琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像分析仪拍摄凝胶照片。以大肠埃希菌ATCC25922或空白为阴性对照(阳性对照DNA由上海生工生物工程技术服务有限公司提供)。

1.3.4 基因序列分析 电泳阳性的PCR产物纯化后用全自动荧光法正、反向测序，采用读序工具Chromas软件察看测序彩图，测序结果登录互联网(www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对。

1.4 统计学处理 药敏结果采用WHONET 5.5软件统计分析。

2 结 果

2.1 药敏试验结果 35株多重耐药SMA的药敏试验结果，见表1。

表1 多重耐药SMA的药敏试验结果(%)

2.2 耐药表型 35株多重耐药SMA β-内酰胺酶试验均为阳性，其中ESBLs阳性为16株(45.7%)，AmpC阳性为5株(14.3%)，MBLs阳性33株(94.3%)，KPC均为阴性，见图1～3。

图1 ESBLs阳性结果

2.3 β-内酰胺酶相关基因检测结果 35株多重耐药SMA中，耐药基因blaTEM、blaSHV、blaCARB、blaIMP、blaOXA-10、oprD2的阳性率分别为22.8%(8/35)、11.4%(4/35)、17.1%(6/35)、94.3%(33/35)、8.6%(3/35)、28.5%(10/35)。未检出blaKPC、blaPER、blaVEB、blaGES、blaVIM、blaSPM、blaGIM、blaDHA、blaOXA-1、blaOXA-2阳性菌株。β-内酰胺酶相关基因检测电泳图，见图4～9(其中，N为阴性对照，P为阳性对照，S为标本，M为DNA标志物，从下向上依次为150、250、350、450、550、650、750、850、1 000、1 500 bp) 。

图2 AmpC阳性结果

图3 MBLs阳性结果

图4 blaTEM基因电泳图

2.4 基因序列分析结果 扩增阳性基因所测序列采用GenBank中的BLAST程序进行同源性分析。blaTEM基因与GenBank注册号为AB282997的TEM-1亚型基因序列相同；blaCARB基因与GenBank注册号为HQ157204的CARB-2亚型基因序列相同；blaOXA-10与GenBank注册号为GU367339的OXA-10亚型基因序列相同；oprD2基因与GenBank注册号为GQ324957的基因序列相同。blaSHV、blaIMP基因与GenBank注册的基因同源性均低于90%，是否是新的基因亚型有待于进一步研究。

图4 blaSHV基因电泳图

图6 blaCARB基因电泳图

图7 blaIMP基因电泳图

图8 blaOXA-10基因电泳图

图9 oprD2基因电泳图

3 讨 论

β-内酰胺类抗菌药物是临床最常用、品种数量最多的抗菌药物[8]，此类抗菌药物具有血药浓度高、杀菌活性强、毒性低、抗菌谱广等特点，因此很受临床青睐。然而近年来随着β-内酰胺类抗菌药物的广泛应用，特别是在临床治疗过程中的预防使用及滥用，使得产β-内酰胺酶的细菌越来越多。β-内酰胺类抗菌药物在此酶的作用下β-内酰胺环水解开环，使其失去了干扰细菌细胞壁合成的功能。目前，临床对产β-内酰胺酶细菌感染的治疗越来越困难，已成为临床医务工作者关注的重点。

本次35株多重耐药SMA中，ESBLs表型检测阳性16株(45.7%)，其中基因检测结果blaTEM阳性8株(22.8%)，blaSHV阳性4株(11.4%)。ESBLs是能水解氧亚胺基β-内酰胺抗菌药物，并可被β-内酰胺酶抑制剂(如舒巴坦、三唑巴坦、克拉维酸)所抑制的一类酶[9-10]。CARB是由质粒介导的羧苄西林酶，它有9个亚型。PCR检出blaCARB阳性菌6株(17.1%)，基因序列分析显示，该菌所产的CARB基因为CARB-2亚型。OXA型酶对氯唑西林、苯唑西林和青霉素有很高的水解活性。PCR检出blaOXA-10阳性菌3株(8.6%)，未检测出携带blaOXA-1、blaOXA-2基因的菌株，表明在本地区，携带blaOXA-10可能导致细菌产ESBLs，它们往往由位于可移动的遗传因子的基因编码，这可能是它们在细菌的广泛传播的原因之一。本次研究中的35株多重耐药SMA，经三维试验检出产AmpC菌5株，占14.3%。PCR未检出携带blaDHA基因的细菌。AmpC能够有效地水解青霉素类、头霉素类和头孢菌素类抗菌药物等，从而导致细菌对第3代头孢菌素产生耐药性。抗菌药物特别是头孢西丁和亚胺培南可使细菌诱导表达AmpC类β-内酰胺酶。本试验中，AmpC阳性表型检出率较高，但未检出携带blaDHA基因的细菌，说明本地区AmpC引起的SMA耐药不是由blaDHA基因编码的质粒介导。本次MBLs三维试验检出阳性菌株33株，阳性率为94.3%，blaIMP基因阳性菌33株，阳性率94.3%，基因检测阳性率与耐药表型阳性率一致。药敏试验显示，35株多重耐药SMA对亚胺培南、美罗培南的耐药率达100.0%，主要与携带MBLs耐药基因blaIMP有关，blaIMP基因阳性率为94.3%，与亚胺培南耐药率基本一致。本次检出oprD2基因阳性菌10株(28.5%)，oprD2基因缺失率高达71.5%，oprD2基因缺失导致SMA对亲水性化合物产生低外膜通透性，抗菌活性可以通过外膜孔蛋白通道(OprD)的缺失而失去抗菌活性[11]。总体而言，本地区的多重耐药SMA对碳青酶烯类抗菌药物的耐药状况非常严重，应引起重视。

[1]Garazi M,Singer C,Tai J,et al.Bloodstream infections caused by stenotrophomonas maltophilia:a seven-year review[J].J Hosp Infect,2012,81(2):114-118.

[2]刘媛,孙明月,王本祥,等.临床非发酵革兰阴性杆菌感染的分布及耐药性分析[J].中华临床感染病杂志,2012,5(2):112-114.

[3]吴明芝,张林,张赤炎,等.254例儿童感染嗜麦芽窄食单胞菌耐药性分析[J].实用预防医学,2010,17(4):774-776.

[4]肖永红,王进,朱燕,等.Mohnarin 2008年度全国细菌耐药监测[J].中华医院感染学杂志,2010,20(16):2377-2383.

[5]黄支密,糜祖煌,石晓霞,等.医院感染革兰阴性杆菌耐消毒剂基因研究[J].中华医院感染学杂志,2005,15(7):721-724.

[6]糜祖煌,陆亚华.氨基糖苷类修饰酶及其基因检测[J].现代实用医学,2004,16(1):13-14.

[7]陈东科,孙长贵.实用临床微生物学检验与图谱[M].北京:人民卫生出版社,2011:797-803.

[8]许恒忠,张鉴.抗菌药物临床合理应用指南[M].北京：化学工业出版社，2008.

[9]Jacoby GA.AmpC β-lactamases[J].Clin Microbiol Rev,2009,22(1):161-182.

[10]李金钟,栗瑛洁.质粒介导AmpC β-内酰胺酶的研究进展[J].国际检验医学杂志,2007,28(7):646-648.

[11]卓志娟,姚莉娟.重症监护病房内嗜麦芽窄食单胞菌医院感染肺炎的临床及耐药研究[J].国际检验医学杂志,2010,31(5):430-431.

Study of distribution of β-lactamase drug resistance gene in 35 strains of multi-drug resistant Stenotrophomonas maltophilia*

LUOHui-li1,CHENShan-shan1,YANGHong-wei2,ZHAOYing2,CHANGRui-jie2△

(1.ShiyanmunicipalMaternalandChildHealthCareHospital,Shiyan,Hubei442000,China; 2.TaiheHospitalofShiyanCity,Shiyan,Hubei442000,China)

Objective To study the drug-resistance phenotype and drug resistance gene in 35 strains of multi-drug resistant Stenotrophomonas maltophilia(SMA) in Shiyan area during 2014.Methods 35 strains of multi-drug resistant SMA isolated from Shiyan area during 2014 were collected and their drug resistance was detected by using the K-B method.ESBLs was detected by using the standard paper strip method.AmpC and MBLs were detected by the three-dimensional test, KPC was detected by the modified Hodge test.The PCR method was adopted to detect the bacterial drug resistance gene and the positive results were performed the forward and reverse gene sequencing analysis.Results Among 35 strains of multi-drug resistance SMA,the positive rates of ESBLs,AmpC,MBLs and KPC were 45.7%,14.3%, 94.3% and 0.0% respectively.The positive rates of drug resistance geneblaTEM,blaSHV,blaCARB,blaIMP,blaOXA-10andoprD2 were 22.8%(8/35),11.4%(4/35),17.1%(6/35),94.3%(33/35),8.6%(3/35) and 28.5%(10/35) respectively.Conclusion The resistance of multi-drug resistance SMA in this area to carbapenem antibacterial drugs is very serious, which should arouse the attention.

nosocomial infection； drug-resistant stenotrophomonas maltophilia； β-lactamase； drug resistant gene

湖北省卫生计生科研基金资助项目(WJ2015Z115)；湖北省十堰市科技局科技计划立项(15K71)。

罗卉丽，女，硕士，主管技师，主要从事肿瘤检验研究。

△通讯作者，E-mail：2671815504@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.19.010

A

1672-9455(2015)19-2839-03

2015-06-05

2015-08-10)