4种放散方法解离免疫球蛋白G抗体效果比较

李 静，陈保民

(河南省安阳市中心血站 455000)



·临床探讨·

4种放散方法解离免疫球蛋白G抗体效果比较

李 静，陈保民

(河南省安阳市中心血站 455000)

目的 比较乙醚放散、冻融放散、热放散及枸橼酸放散4种技术对RhD免疫球蛋白(Ig)G抗体的放散效果。方法 采用乙醚放散、冻融放散、热放散及枸橼酸放散4种放散技术分别进行RhD IgG抗体的放散，放散液进行抗体效价测定及统计学分析；将2014年1～5月临床确诊为Rh新生儿溶血病的16例标本分别用4种方法进行放散，比较抗体检出率及临床诊断吻合度。结果 不论放散细胞上抗体的致敏性强弱，乙醚放散与枸橼酸放散解离抗体效果最好，其次是冻融放散，最弱的是热放散；4种方法的特异性均为100%；敏感性方面，乙醚放散与冻融放散和热放散比较，t值分别为4.11和9.34，差异有统计学意义(P<0.05)。乙醚放散与枸橼酸放散比较，t值为0.826，差异无统计学意义(P<0.5)；临床16例Rh新生儿溶血病标本，乙醚放散与枸橼酸放散检出全部抗体，而冻融放散漏检2例，热放散漏检3例。结论 对于RhD IgG抗体的放散，乙醚放散与枸橼酸放散在特异性、敏感性及准确性方面相似且均优于冻融放散和热放散。

IgG抗体放散； 乙醚放散； 冻融放散； 热放散； 枸橼酸放散

抗体释放试验是诊断新生儿溶血病3项试验中最具有价值的一项试验。通常ABO血型免疫球蛋白(Ig)M抗体以热放散法为常用，Rh血型IgG抗体以乙醚放散法为常用[1]。由于乙醚易燃、低毒、麻醉的特殊性，受到公安部门管制。为了能找到一种与乙醚放散效果相接近的放散技术，本文选择了冻融放散、热放散及枸橼酸放散3种放散技术与乙醚放散进行RhD IgG抗体的放散效果比较，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014年1～5月临床确诊为Rh新生儿溶血病的16例标本。

1.2 仪器与试剂 普通离心机(TDZ4-WS，湖南赛特湘仪)；细胞洗涤离心机(KA-2200，日本久保田)；37 ℃、56 ℃水浴箱(HH-600，苏州威尔)；4 ℃药用冷藏柜[MPR-312D(CN)-C，大连三洋]；-30 ℃低温保存箱(MDF-U338-C，大连三洋)；快速混匀器(SK-1，苏州金坛)；酸度计(PHS-25，上海虹益)；IgG抗-D(20130930，上海血液生物医药公司)；生理盐水(20130923，山东华鲁制药公司)；无水乙醚；O细胞(201545303，上海血液生物医药公司)；多特异性抗人球蛋白试剂(20130904，上海血液生物医药公司)；枸橼酸(20131016，天津天力)；磷酸三钾(20130320，天津科密欧)；HCL(130406，开封开化)；磷酸三钠(20110103，天津天力)。

1.3 方法

1.3.1 致敏红细胞的制备 随机抽取O型RhD阳性无偿献血红细胞标本10份混匀，经洗涤后制成压积红细胞，分成3份备用。取两份压积红细胞分别与IgG抗-D试剂以1∶1、1∶3比例混匀，置37 ℃水浴10 min后再次洗涤至少6次制成致敏压积红细胞。最后一次洗涤时的上清液与相应细胞反应为阴性，且致敏红细胞做直抗试验结果为1∶1比例凝集度小于或等于2+、1∶3比例凝集度大于3+方为合格。

1.3.2 阴性对照红细胞的制备 将1.3.1步骤中剩余的一份洗涤压积红细胞做直抗试验，结果为阴性即可作为阴性对照红细胞。

1.3.3 乙醚放散和热放散试验 取适量致敏压积红细胞与阴性对照红细胞按照《免疫血液学》[2]第十二章“放散试验”方法平行放散5次，放散液进行IgG抗体效价测定。

1.3.4 冻融放散和枸橼酸放散试验 取适量致敏压积红细胞与阴性对照红细胞按照《实用血液免疫学血型理论和实验技术》[3]第三十章“吸收放散试验”方法平行放散5次，放散液进行IgG抗体效价测定。

1.3.5 将16例标本分别用4种方法进行放散，比较4种方法的抗体检出率。

1.4 统计学处理 使用SPSS19.0统计学软件。计数资料以率表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 将凝集强度为强阳性(>3+)和弱阳性(≤2+)的致敏压积红细胞及阴性对照红细胞分别用4种方法进行放散。阴性对照红细胞放散结果为阴性，强阳性和弱阳性的致敏压积红细胞均放散出抗体。放散液IgG抗体效价测定及红细胞凝集强度积分结果见表1。

表1 4种放散方法IgG抗体效价及凝集强度积分结果

2.2 4种放散方法敏感性及特异性比较 4种放散方法所得放散液中IgG抗体的平均凝集积分见表2。表明4种放散技术放散IgG抗体的特异性均为100%；就敏感性而言，不论致敏红细胞的凝集度强弱，乙醚放散与枸橼酸放散比较;乙醚放散与冻融放散和放散比较，t值为0.826，差异无统计学意义(P>0.05)，且均明显高于冻融放散和热放散，t值分别为4.11和9.34，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 4种放散方法放散液中抗体效价平均积分比较(分)

2.3 16例临床标本4种放散方法的检测结果 乙醚放散与枸橼酸放散16例阳性标本的检出率为100.0%，而冻融放散漏检2例，热放散漏检3例。见表3。

2.4 4种方法放散过程中压积红细胞及放散液状态 冻融放散所需的压积红细胞量最多，但所得放散液最少。而对于放散液状态，乙醚放散、冻融放散的放散液颜色暗红、浑浊、不透明；加热放散的放散液虽为樱红色，但透明度仍不高；枸橼酸放散的放散液状态最好，为极浅透明红色。见表4。

表3 16例临床标本4种放散方法的检测结果

表4 4种方法放散过程中压积红细胞及放散液状态比较

3 讨 论

实验室用于抗体放散的方法主要有热放散法、冻融放散法、超声放散法、微波放散法等物理方法，也有乙醚法、枸橼酸法、氯仿法、二氯甲烷法、三氯乙烯-三氯甲烷法、磷酸氯喹法等化学方法[4-5]。其中氯仿法是一种能同时放散IgG和IgM抗体的试验方法，很早便被美国血库协会的工具书列为常规方法，但氯仿在使抗体解离的同时会使红细胞本身蛋白质严重变性[6]，同时含氯试剂有毒，容易造成人员和环境污染；超声放散法和微波放散法操作时需要特殊仪器；对于磷酸氯喹放散法，试剂易残留，影响试验结果。所以本文选择了两种物理放散法(热放散、冻融放散)和两种化学放散法(乙醚放散、枸橼酸放散)进行放散效果的比较。

根据表1可以看出，不论放散细胞上抗体的致敏性强弱，乙醚放散与枸橼酸放散的放散效果最好，其次是冻融放散，最弱的是热放散。经过计算放散液中IgG抗体的平均凝集积分，4种方法放散IgG抗体的特异性均为100%；但就敏感性而言，乙醚放散与冻融放散和热放散比较，t值分别为4.11和9.34，差异有统计学意义(P<0.05)。乙醚放散与枸橼酸放散比较，t值为0.826，且均明显高于冻融放散和热放散技术，差异无统计学意义(P>0.5)。为了验证试验结果，将临床确诊为Rh新生儿溶血病的16例标本分别用4种方法进行抗体放散，结果乙醚放散与枸橼酸放散的抗体检出率均为100.00%，而冻融放散漏检2例，热放散漏检3例。郑凌等[7]也对临床患者红细胞热放散与酸放散的检测结果进行了比较，显示热放散的放散效果明显差于酸放散。

比较4种方法放散过程中压积红细胞及放散液状态可以看出，由于乙醚放散、冻融放散和热放散中的放散细胞均受到了不同程度的破坏，造成放散液透明度不高，影响盐水、酶法及凝聚胺一步法试验结果的观察。而且冻融放散所需红细胞较多，如果放散液需要进行抗体鉴定，需要大量的红细胞才能满足试验需求。枸橼酸放散的原理是解离红细胞膜上致敏的IgG抗体对红细胞进行抗原鉴定，因此红细胞膜破坏程度轻，放散后的红细胞还可进行其他试验，所得放散液量多且清澈，不影响各种方法凝集试验结果的直接观察。但值得注意的是该方法需在进行振摇前才能加入枸橼酸溶液，加入时间过长会使红细胞溶血。同时，该方法可破坏Kell系统抗原，放散后的细胞不能进行Kell系统定型实验。

对于RhD IgG抗体的放散，乙醚放散与枸橼酸放散在特异性、敏感性及准确性方面相接近，且均优于冻融放散和热放散。但作为两种物理放散方法，冻融放散和热放散制备抗体最容易。因此，在临床实践中应根据具体情况选择适合的方法，才能得到理想的结果。

[1]中华人民共和国卫生部医政司．全国临床检验操作规程[M]． 3版．南京：东南大学出版社，2006：256．

[2]丁苏鄂．常用血清学检查技术[C].上海：上海科学技术出版社，2002：222．

[3]童军，刘庆海，杨文冲．血型血清学实验方法[C].北京：科学出版社，2006：631-632．

[4]郑凌，刘衍春，吴敏慧，等．甘氨酸-HCl/EDTA酸放散法在AIHA标本配血中的应用[J]．中国输血杂志，2013，26(10)：1005-1007．

[5]安万新，于卫建．输血技术学[M]．北京：科学技术文献出版社，2006：277．

[6]孙爱农，鲍自谦，查勇．解离红细胞致敏抗体的3种方法比较[J]．中国输血杂志，2004，17(1)：17-19．

[7]郑凌，刘衍春，吴敏慧.甘氨酸-HCL/EDTA酸放散法在A2HA标本配血中的应用[J].中国输血杂志，2013,26(10)：1005-1007.

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.13.058

A

1672-9455(2015)13-1947-03

2015-01-20

2015-03-12)