某市苗族、侗族及汉族乙型肝炎病毒基因分型及耐药基因检测

欧 阳,陈 玲,丁显平

(1.四川大学生命科学学院/特色生物资源研究与利用川渝共建重点实验室，成都 610064；2.贵阳医学院第二附属医院，贵州凯里 556000)



·论 著·

某市苗族、侗族及汉族乙型肝炎病毒基因分型及耐药基因检测

欧 阳1,2,陈 玲2,丁显平1△

(1.四川大学生命科学学院/特色生物资源研究与利用川渝共建重点实验室，成都 610064；2.贵阳医学院第二附属医院，贵州凯里 556000)

目的 研究凯里市苗族、侗族及汉族乙型肝炎病毒(HBV)的基因分型和耐药基因变异状况。方法 采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)和基因芯片反向斑点杂交技术检测凯里市苗族、侗族及汉族293例乙型肝炎患者基因型和对拉米夫定、阿德福韦耐药突变基因型。用试剂盒自带的阴性、阳性对照作为每次测定的质控,确保结果的准确性。结果 (1)HBV基因型检测到B型及C型,其中B型259例(88.4%),C型25例(8.5%),无法分型9例(3.1%)。汉族B基因型比例低于苗族和侗族，C基因型比例明显高于其他2个民族，其基因型分布与其他少数民族比较，差异有统计学意义(χ2=15.55，P<0.01)；(2)286例对拉米夫定敏感，7例对拉米夫定耐药；7例对拉米夫定耐药的突变基因中，为苗族和汉族患者，侗族未见拉米夫定耐药。但3个民族HBV耐拉米夫定变异检出率比较，差异无统计学意义(χ2=3.20，P>0.05)。所有293例患者均对阿德福韦敏感。结论 凯里市HBV基因型以B型为主；HBV基因B型患者易对拉米夫定耐药，且以突变基因型以180M和204V为主。

乙型肝炎病毒； 基因型； 耐药基因； 基因芯片

乙型肝炎病毒(HBV)有8种不同的基因型包括A～H[1-2]，近年又有报道发现新的I型和J型[3-4]。人类感染HBV基因型的类别有可能与疾病的感染谱、疾病的进展、感染途径有一定的联系[5]，HBV基因容易发生基因的进化和基因的遗传变异[6]。HBV基因型耐药动态检测以及耐药性突变的频率差异对乙型肝炎抗病毒治疗药物疗效评价具有重要的指导意义。为了解凯里市苗族、侗族及汉族的HBV基因分型和耐药基因变异状况，本文采用了膜基因芯片技术对凯里市苗族患者96例、侗族患者89例、汉族患者108例的HBV基因型和耐药变异进行了检测，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 所有患者均来自贵阳医学院第二附属医院，且乙型肝炎表面抗原阳性。其中苗族96例，平均年龄(38±17)岁，男51例，女45例；侗族89例，平均年龄(32±14)岁，男48例，女41例；汉族108例,其中男79例,女29例,平均年龄(35±13)岁。患者诊断符合2010年中华医学会传染病与寄生虫分会、肝病学分会联合修订的“慢性乙型肝炎防治指南”诊断标准[7]，均未经拉米夫定等药物抗病毒治疗，血清甲、丙、戊、庚型肝炎病毒均为阴性。

1.2 试剂 乙型肝炎标志物(包括乙型肝炎表面抗原、表面抗体、e抗原、e抗体和核心抗体)检测试剂盒由厦门新创公司提供，批号20131123；甲、丙、戊、庚型肝炎病毒抗体检测试剂盒由厦门新创公司提供，批号201301031；乙型肝炎病毒DNA荧光定量检测试剂盒由深圳匹基有限公司提供，批号20131203；HBV基因分型及耐药变异检测试剂盒由深圳亚能科技有限公司提供，批号20140101。

1.3 仪器 HBV DNA检测用荧光聚合酶链反应(PCR)仪(由杭州博日科技有限公司提供)；基因分型及耐药变异检测用Rotor-GeneQ 凯杰实时荧光定量PCR仪(由德国凯杰公司提供)；FYY-3型杂交仪(兴化市分析仪器厂生产)。

1.4 方法

1.4.1 标本采集空腹采集慢性乙型肝炎患者抗凝静脉血3 mL，3 000 r/min，离心10 min，分离血清置1.5 mL离心管中4 ℃或-20 ℃储存备用。

1.4.2 荧光定量PCR检测HBV DNA采用德国凯杰有限公司提供试剂盒，DNA提取采用煮沸法：取血清100 μL加入100 μL DNA提取液，混匀后离心10 min，弃上清液，加入25 μL DNA裂解液，放置10 min混匀，100 ℃煮沸10 min，离心取上清液2 μL放入装有生物素标记引物的PCR反应管中加入2 μL已处理好的标本，按下列条件扩增：37 ℃ 5 min，94 ℃预变性1 min，然后按95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。

1.4.3 对复检表面抗原阳性者进行HBV DNA荧光定量，对荧光定量大于1×104copy/mL者进行基因分型及耐药变异检测。基因芯片反向斑点杂交检测采用深圳亚能生物技术有限公司产品。基因芯片反向斑点杂交PCR扩增DNA提取采取柱层析法：取1.5 mL离心管，加入20 μL蛋白酶K，再加入200 mL血清和200 μL裂解液，混匀后放入56 ℃恒温裂解10 min，裂解完成后加入300 μL无水乙醇，混匀。取离心柱置于收集管内，转移1.5 mL离心管内的样本处理液到离心管内，盖上管盖，1 200 r/min离心1 min，弃滤液，加入700 μL洗液Ⅰ(已加入13 mL无水乙醇),1 200 r/min离心1 min，弃滤液，加入700 μL洗液Ⅱ,1 200 r/min离心1 min，弃滤液，1 400 r/min离心2 min，弃收集管，将离心柱置于干净的1.5 mL离心管中，开盖室温放置5 min，加入50 mL洗脱液，盖上管盖室温静置3 min，800 r/min离心2 min。取3 μL用于PCR扩增反应。扩增完成后，PCR产物煮沸变性10 min，加入反应膜条置42 ℃杂交2 h。用洗脱液洗膜2次，加入辣根过氧化物酶标记的亲和素，最后用NBT/BCIP系统显色，根据紫色斑点出现的位置和顺序直接判断结果。用试剂盒自带的阴性、阳性对照作为每次测定的质控,确保结果的准确性。

1.4.4 结果判断 基因分型及耐药变异检测采用膜芯片反向点杂交方法，用生物素-亲和素酶联反应显色，在进行B、C、D分型的同时检测拉米夫定和阿德福韦2种药物的5个常见耐药突变位点。如果质控位点出现蓝色表示该结果有效，在某一基因型检测位点显色表明该HBV为相应的基因亚型，只在药物敏感位点出现显色点表示HBV对该药敏感，一旦在耐药位点出现显色点即表示耐药。

1.4.5 其他(甲、丙、戊、庚)型肝炎病毒抗体检测试剂盒由厦门新创公司提供，具体操作按照说明书。

1.4.6 乙型肝炎标志物采用酶联免疫吸附试验检测，试剂盒由北京科美公司提供，严格按试剂盒说明书操作。

1.5 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行分析，计数资料以率表示，比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 293例乙型肝炎患者HBV基因分型及分布 苗族以B型为主,其次为C型;侗族以B型为主,其次为C型，汉族以B型和C型为主。在3个民族中未发现除B、C基因型以外的其他HBV基因型。见表1。

表1 侗族、苗族与汉族慢性乙型肝炎患者基因型分布情况[n(%)]

注：与苗族、侗族相比，χ2=15.55，*P<0.01。

2.2 293例乙型肝炎患者HBV基因分型分布比较 本地区HBV基因型检测到B型以及C型,其中B型259例(占88.4%),C型25例(占8.5%),无法分型9例(占3.1%)。由表2可以看出苗族、侗族和汉族中B基因型占绝对优势，但汉族B基因型比例低于苗族和侗族，C基因型比例明显高于其他2个民族，其基因型分布与其他少数民族比较，差异有统计学意义(χ2=15.55，P<0.01)，3个少数民族均发现有少量的未分型HBV感染。

2.3 293例乙型肝炎患者耐药突变情况 293例乙型肝炎患者中，286例对拉米夫定敏感，7例对拉米夫定耐药；7例对拉米夫定耐药的突变基因型中，为苗族和汉族患者，侗族未见拉米夫定耐药。突变基因型以180M和204V为主,但3个民族HBV耐拉米夫定变异检出率比较，差异无统计学意义(χ2=3.20，P>0.05)。所有患者均对阿德福韦敏感，未检测出耐药突变基因型。见表2。

表2 7例拉米夫定耐药突变基因型[n(%)]

注：3个民族相比，χ2=3.20，P>0.05。

3 讨 论

目前人类已发现的HBV基因型共8种即A～H。由于HBV变异进化后使得HBV在自然感染过程中反映了不同基因型的变异特点。HBV感染后的临床过程有很多种，不仅宿主的感染方式和宿主的免疫状况有关，还与感染HBV株的基因型种类有关[8-9]。近几年来，大批学者发现HBV基因型具有地理区域性分布特征[10-12]，各地区优势基因型不同，病毒株也有很大差异，预后也各不一样，所以基因分型的检测在流行病学上对传染源的追踪研究和传播途径具有很重要的意义。

在我国以C型和B型为主[13-17]，其中南方地区以B型为主，北方地区以C型为主。本次检测到该地区乙型肝炎患者HBV基因型存在B型及C型,其中B型259例(88.4%),C型25例(8.5%),无法分型9例(3.1%)。无其他明确型别及混合型，有4例汉族、3例苗族患者无法分型,可能为其他基因型的HBV感染，因采用的试剂盒检测探针是针对我国比较常见的B型、C型和D型设计的，而对少见的其他基因型不能检出。检测中以B型为优势基因，占总体标本的88.4%,其中苗族患者病毒B基因型占苗族标本的94.8%，侗族患者病毒B基因型占侗族标本的91.0%，汉族组B基因型占汉族标本的80.6%,汉族与苗族和侗族比较差异有统计学意义(P<0.05)。本研究提示贵州省凯里市的侗、苗族及汉族乙型肝炎患者HBV基因型以B型为主,C型较少，与丁静娟等[13]报道一致。

目前治疗乙型肝炎的主要药物有阿德福韦、拉米夫定、干扰素等。越来越多的学者开始关注感染HBV不同基因型的患者对抗病毒治疗反应的差异。拉米夫定作为乙型肝炎一线抗病毒治疗药物，主要耐药机理是HBV DNA聚合酶基因发生突变，导致与拉米夫定的结合力降低，7例对拉米夫定耐药的突变基因型中，突变基因型以180M和204V为主,使用过抗病毒药物泛昔喏韦治疗可引起180M突变，所以需要排除这个药物的干扰。本次所有患者都无使用泛昔喏韦的病史。新型抗病毒药物阿德福韦酯是继拉米夫定后的新型抗病毒药物，因为与其他核苷酸类似物无交叉耐药而且近期使用耐药率低，所以在抗HBV治疗中起到很重要的作用。但有研究发现,阿德福韦酯长期使用也可导致HBV发生耐药突变。目前已证实与阿德福韦酯耐药相关的突变位点主要为rtA181和rtN236。卜范峰等[18]研究发现，肝硬化、乙型肝炎E抗原阴性状态、年龄和阿德福韦耐药与拉米夫定耐药变异发生明显相关。但本文293例患者未检测出阿德福韦耐药突变基因型。虽然本次耐药变异所占的比例较小，但对于即将进行抗病毒治疗或者治疗后无作用的患者，有必要检测HBV耐药变异情况，便于指导临床医生合理科学地制订抗病毒治疗方案，以便能达到更好的治疗效果。

本研究表明，利用基因芯片技术检测HBV基因型及耐药性发生与否，1次试验就能为乙型肝炎临床诊疗提供多项参考信息。由于该方法具有高通量，快速灵敏，多个平行检测基因的优点，而且还可进行动态监测，提前发现，及时调整治疗方案等目的，对于针对性指导临床用药具有重要意义，因而在HBV基因分型和耐药变异检测中前景看好。目前有证据表明HBV基因型与疾病发展和临床治疗效果有着密切关系，在明确基因型后进行抗病毒治疗，可使抗病毒治疗的方案个体化，达到治疗效果的最优化。同时也可积累不同基因型在人类学、流行病学、病原学、临床治疗等方面的资料，为以后其它药物治疗乙型肝炎患者提供有效的、有意义的研究线索。

综上所述，贵州省凯里市乙型肝炎患者HBV基因型以B型为主。乙型肝炎患者在抗病毒治疗中应监测常见耐药位点的突变，通过对长期服用拉米夫定和阿德福韦酯药物患者进行HBV基因型检测和耐药突变，有助于了解不同基因型患者的HBV相关耐药基因情况，便于抗病毒药物的更换和选择，为个体化抗病毒治疗方案提供更有利的科学依据。

[1]焦敏，何江，余伍忠．PCR及其衍生技术在乙型肝炎病毒定量检测中的应用进展[J]．中国优生与遗传杂志，2010，(12)：9-11．

[2]La TG,Nicolotti N,De WC,et al.An assessment of the effect of hepatitis B vaccine in decreasing the amount of hepatitis B disease in Italy[J].Virol J,2008,5(1):84-90.

[3]Olinger CM,Jutavijittum P,Hubschen JM,et al.Possible new hepatitis B virus genotype,Southeast Asia[J].Emerg Infect Dis,2008,14(11):1777-1780.

[4]Tatematsu K,Tanaka Y,Kurbanov F,et al.A genetic variant of hepatitis B virus divergent from known human and ape genotypes isolated from a Japanese patient and provisionally assigned to new genotype J[J].J Virol,2009,83(20):10538-10547.

[5]杨柳，张红梅，徐娇阳，等．新疆地区回族、汉族人群HBV基因分型的研究[J]．中国输血杂志，2014，27(9)：936-939．

[6]于红缨，邵凌云，符政远，等．湖南省怀化市少数民族及汉族慢性乙型肝炎患者病毒基因分型及临床分析[J/CD]．中华实验和临床感染病杂志:电子版，2008，2(1)：44-49．

[7]贾继东，李兰娟．慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J]．胃肠病学，2011,10(6)：351-366．

[8]黄彬，陈茶，陈利达．乙型肝炎病毒基因型检测及其临床意义[J]．中华医院感染学杂志，2011，21(9)：1749-1751．

[9]段建平，朱坤，吴薇佳，等．乙型肝炎病毒基因型与YMDD基因区序列突变及BCP突变关系探讨[J]．中华检验医学杂志，2011，34(1)：68-72．

[10]Biswas A,Panigrahi R,Pal M,et al.Shift in the hepatitis B virus genotype distribution in the last decade among the HBV carriers from eastern India:possible effects on the disease status and HBV epidemiology[J].J Med Virol,2013,85(8):1340-1347.

[11]Kurbanov F,Tanaka Y,Mizokami M.Geographical and genetic diversity of the human hepatitis B virus[J].Hepatol Res,2010,40(1):14-30.

[12]郭乐，申元英．中国少数民族HBV基因型地理分布研究进展[J]．中国公共卫生，2014，30(7)：962-964．

[13]丁静娟，彭亮，张权，等．贵州侗族、苗族和汉族人群乙型肝炎病毒基因型分布[J]．中华实验和临床病毒学杂志，2004，18(3)：230-233．

[14]王虹，冯妙芙，周东耀，等．荧光分子信标探针检测拉米夫定耐药基因的研究[J]．中国生物工程杂志，2003，23(6)：90-93．

[15]刘建湘，蒋黎．戊型肝炎重叠慢性乙型肝炎病毒感染临床分析[J]．中国现代医学杂志，2012，22(24)：76-78．

[16]艾敏，赵伟，陶晨，等．乙型肝炎病毒外膜大蛋白检测在恩替卡韦抗病毒治疗中的临床意义[J]．江苏医药，2012，38(23)：2809-2811．

[17]张晓平，邱丽影，秦俊生，等．深圳地区乙型肝炎病毒基因分型与核苷类药物[J]．国际检验医学杂志，2009，30(12)：4．

[18]卜范峰，鲁艳芹，韩金祥，等．实时定量PCR检测乙型肝炎病毒拉米夫定耐药突变及其与临床指标的相关性[J]．中国生物制品学杂志，2008，21(9)：806-809．

Genotyping and detection of drug resistance gene of hepatitis B virus among Miao,Dong and Han nationalities in a city

OUYang1,2,CHENLing2,DINGXian-ping1△

(1.BioresourceResearchandUtilizationJointKeyLaboratoryofSichuanandChongqing,CollegeofLifeScience,SichuanUniversity,Chengdu,Sichuan610014,China;2.SecondAffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege,Kaili,Guizhou556000,China)

Objective To research the genotyping and drug resistance gene mutation status of hepatitis Bvirus(HBV) among Miao,Dong and Han nationalities in Kaili city of Guizhou province.Methods The quantitative PCR and reverse dot blot hybridization microarray technology were adopted to detect the HBV genotypes and lamivudine,adefovir resistant mutations genotypes in 293 cases (Miao,Dong and Han nationalities) of hepatitis B.The negative control and positive control of the reagent kit served as the quality control in each determination for ensuring the accuracy of the results.Results (1) 259 cases of genotype B (259/293,88.4%) and 25 cases of genotype C (25/293,8.5%) were detected,and 9 cases(3.1%) were unable genotyping.A lower frequency of genotype B in Han population was found compared to Miao and Dong population and a higher frequency was seen in genotype C,resulting in statistical significance in genotyping distribution compared with other minorities(χ2=15.55，P<0.01).(2)286 cases were sensitive to lamivudine.7 cases showed lamivudine resistance,and all these 7 cases were Miao or Han patients without lamivudine resistance in Dong population,and lamivudine-resistant HBV mutation detection rate had no statistically significant difference among the three ethnic groups (χ2=3.20，P>0.05).All 293 patients were sensitive to adefovir.Conclusion Genotype B is the dominant HBV genotype in Kaili city.HBV genotype B patients easily become lamivudine-resistant and the mutant genotype mainly are 180M and 204V.

HBV； genotype； resistance gene； gene chip

欧阳，女，本科，检验师，主要从事临床检验工作。

△通讯作者：E-mail:Brainding@scu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.13.011

A

1672-9455(2015)13-1845-03

2015-01-25

2015-03-08)