双歧杆菌的脂磷壁酸对巨噬细胞MAPK的影响

2015-03-16 06:57李迎雪
检验医学与临床 2015年13期
关键词:双歧磷酸化抑制剂

李迎雪,宋 洋,姚 君,张 茹

(广东省深圳市人民医院消化内科 518020)



·论 著·

双歧杆菌的脂磷壁酸对巨噬细胞MAPK的影响

李迎雪,宋 洋,姚 君,张 茹

(广东省深圳市人民医院消化内科 518020)

目的 探讨双歧杆菌的脂磷壁酸(LTA)对巨噬细胞丝裂源活化蛋白激酶(MAPK)活性的影响。方法 选取6~8周龄巴比赛(BALB/c)小鼠90只,按随机数字表达法分为九组,每组10只,A组腹腔注射磷酸缓冲盐溶液(PBS);B组腹腔注射LTA;C组腹腔注射LTA+细胞外调节蛋白激酶(ERK)抑制剂;D组腹腔注射LTA+c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂;E组腹腔注射LTA+p38抑制剂;F组腹腔注射LTA+ERK及JNK抑制剂组;G组腹腔注射LTA+ERK及P38抑制剂组;H组腹腔注射LTA+JNK及P38抑制剂;I组腹腔注射LTA+3种抑制剂。九组小鼠注射5 d,每天注射1次,饲养7 d后,处死全部小鼠,采用免疫印迹法检测九组小鼠腹腔巨噬细胞MAPK家族中ERK1/2、p38MAPK和JNK蛋白的磷酸化水平。结果 (1)B组小鼠腹腔巨噬细胞ERK1/2蛋白磷酸化水平较A组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);两组小鼠腹腔巨噬细胞p38MAPK和JNK平均荧光强度差异无统计学意义(P>0.05);(2)向小鼠腹腔注射抑制剂的其他七个组别,其相应的蛋白表达水平几乎为零,且对其他蛋白表达无影响。结论 LTA可能是通过活化巨噬细胞MAPK家族中ERK1/2来激活巨噬细胞表达、合成和分泌细胞因子,抑制剂能够有效阻断蛋白表达通路,对其他蛋白表达无影响。

双歧杆菌; 脂磷壁酸; 巨噬细胞; 丝裂源活化蛋白激酶

双歧杆菌是黏附于人类肠道最主要的细菌,是有益菌群之一,通过维持机体肠道内菌群平衡来维护宿主的健康[1]。随着医疗技术和微生物生态学的发展,学者们越来越重视对双歧杆菌的研究。脂磷壁酸(LTA)是双歧杆菌细胞壁的重要大分子,也是双歧杆菌发挥其抗菌、抗衰老、抗肿瘤及调节机体免疫功效的重要结构成分之一[2]。LTA是以1,3磷酸二脂键连接的而成的线性磷酸甘油多聚体,是一种无不良反应的调节剂[3]。巨噬细胞MAPK是由脯氨酸介导的丝氨酸、酪氨酸双重磷化作用的蛋白激酶,ERK1/2和p38MAPK是MAPK信号传导通路中信号蛋白分子,MAPK对巨噬细胞具有活化、刺激作用,能够有效地促进巨噬细胞的吞噬能力。研究表明,LTA能够通过活化NF-кB、AP-1和MAPK家族中ERK1/2、p38MAPK来激活巨噬细胞信息通道,促使巨噬细胞表达和分泌细胞因子,加强巨噬细胞吞噬能力,增强细胞毒作用,抑制体内多种肿瘤的生长[4-5]。为了解LTA激活巨噬细胞信息通道,分泌细胞因子的机制,笔者做了相关研究,通过观察小鼠腹腔巨噬细胞MAPK家族中ERK1/2、p38MAPK和JNK的含量,来研究双歧杆菌的LTA对巨噬细胞MAPK的影响机制,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源 6~8周龄BALB/c小鼠90只,体质量20~23 g,其中雌鼠45只,雄鼠45只(小鼠购于河南省动物实验中心)。

1.2 LTA提取 在LB培养基中接种双歧杆菌,于37 ℃的无氧环境中培养,48 h后裂解,离心并收集上清液。上清液置入50 ℃的水浴锅中恒温,待上清液分层后收集上层溶液,用醋酸铵缓冲液洗脱溶液。

1.3 给药方法 小鼠第1天,空腹注射10%硫乙醇酸盐肉汤2 mL,第2天起,给予不同试剂。A组注射磷酸缓冲盐溶液(PBS)0.2 mL,B组腹腔注射LTA;C组腹腔注射LTA +细胞外调节蛋白激酶(ERK)抑制剂;D组腹腔注射LTA+ c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂;E组腹腔注射LTA+p38抑制剂;F组腹腔注射LTA+ERK及JNK抑制剂组;G组腹腔注射LTA+ERK及P38抑制剂组;H组腹腔注射LTA+JNK及P38抑制剂;I组腹腔注射LTA+3种抑制剂。1次/天,连用5 d(LTA剂量均为10 μg,3种抑制剂剂量均为0.2 mL,均购于美国Selleck公司)。

1.4 巨噬细胞收集及培养 7 d后,处死小鼠,Hank′s液灌洗腹腔,收集灌洗液。将细胞数调至106/mL,取100 μL细胞悬液置于培养板中,37 ℃下5% CO2孵箱中培养2 h,加入100 μL的10%小牛血清的RPMI1640营养液和终极浓度为10 ng/mL脂多糖(LPS),培养24 h后,置于-30 ℃环境中保存。

1.5 免疫印迹法检测九组小鼠p-ERK1/2、p-p38和p-JNK的蛋白表达 离心收集细胞,PBS洗涤3次,加入裂解液,于4 ℃水中冰浴30 min,1 200 r/min离心10 min,吸取上清液。BCA法进行蛋白定量,后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)凝胶电泳分离,并将蛋白质转移到PVDF膜上,成像后分析结果。

2 结 果

2.1 A、B两组小鼠腹腔内巨噬细胞MAPK家族中ERK1/2、p38和JNK的蛋白表达水平比较 经LTA刺激后的B组小鼠腹腔巨噬细胞ERK1/2蛋白表达水平较A组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);两组小鼠腹腔巨噬细胞p38MAPK和JNK蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 两组小鼠巨噬细胞ERK1/2、p38和JNK蛋白表达水平比较情况

注:与A组比较,*P<0.05。

2.2 B、C、D、E四组小鼠腹腔内巨噬细胞MAPK家族中ERK1/2、p38和JNK的蛋白表达水平比较 与B组比较,加入ERK抑制剂的C组小鼠,ERK1/2蛋白磷酸化水平几乎为零;加入JNK抑制剂的D组小鼠,JNK蛋白磷酸化水平几乎为零;加入p38抑制剂的E组小鼠,p38蛋白磷酸化水平几乎为零。见表2。

表2 B、C、D、E组小鼠ERK1/2、p38和JNK蛋白表达水平比较

2.3 F、G、H、I 四组小鼠ERK1/2、p38和JNK蛋白磷酸化水平表达比较 F组加入ERK和JNK抑制剂,其ERK1/2和JNK蛋白几乎为零表达;G组和H组如同F组,加入抑制剂所对应的蛋白磷酸化表达几乎为零;I组加入3种抑制剂,则ERK1/2、JNK和p38蛋白几乎为零表达。见表3。

表3 F、G、H、I组小鼠ERK1/2、p38和JNK蛋白表达水平比较情况

3 讨 论

双歧杆菌是动物和人类肠道中重要的生理性有益菌群,维护肠道菌群平衡及机体健康[6-8]。LTA是革兰阳性菌细胞壁内的重要大分子结构,其亲水端参与细菌黏附定值作用,疏水端能够与细胞膜紧密相连,LTA参与体内免疫调节,抑制肿瘤生长,激活局势细胞吞噬能力,是无不良反应的生物调节剂[9]。目前研究证实,双歧杆菌的LTA通过激活巨噬细胞多种信息通道,活化巨噬细胞,增强巨噬细胞吞噬能力,降低消化道疾病发生,也为预防和治疗胃肠道疾病提供重要依据,但对LTA促使巨噬细胞表达的机制目前尚未清楚[10]。

ERK通路、p38MAPK通路、JNK/SAPK通路及BMK通路这4条通路路可以介导多种细胞信号,演变为细胞信号转导的汇聚通路[11-12]。MAPK能够启动细胞内信号传递系统,介导p38MAPK激活,活化哺乳动物转录因子家族(NF-кB)和铁氧还蛋白转录类似因子1(AP-1),促使巨噬细胞的表达、合成和分泌白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α[13]。相关研究表明,诸多因子如集落刺激因子-1、前列腺素E2以及酵母多糖能够活化巨噬细胞,其主要途径是提高ERK1/2、p38MAPKA和AP-1的活性[14-15]。本研究结果显示,经双歧杆菌的LTA刺激后的小鼠腹腔巨噬细胞MAPK中ERK1/2蛋白磷酸化水平明显要高于注射PBS组,而A组和B组小鼠腹腔巨噬细胞MAPK家族中p38MAPK和JNK水平无明显差异,加入抑制剂的其他七组,其相应的蛋白磷酸化表达均几乎为零,这表明双歧杆菌的LTA通过活化MAPK家族中ERK1/2激活小鼠巨噬细胞表达、合成和分泌细胞因子,以增强巨噬细胞的吞噬能力;抑制剂能够有效阻断ERK1/2、JNK和p38通路,且抑制剂不能影响其他蛋白水平表达。但LTA对巨噬细胞MAPK家族中JNK和p38MAPK水平影响不大。

综上所述,双歧杆菌的LTA能够通过活化巨噬细胞MAPK家族中ERK1/2水平,促进巨噬细胞表达、合成和分泌IL-1、IL-6及肿瘤坏死因子-α,增强其杀伤活性和细胞毒作用,为临床预防和治疗消化道疾病提供重要参考依据。

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Effects of bifidobacterium lipoteichoic acid on macrophages MAPK*

LIYing-xue,SONGYang,YAOJun,ZHANGRu

(DepartmentofGastroenterology,ShenzhenMunicipalPeople′sHospital,Shenzhen,Guangdong518020,China)

Objective To study the influence of bifidobacterium lipoteichoic acid (LTA) on macrophage mitogen activated protein kinase (MAPK) activity of macrophages.Methods 90 BALB/c mice with 6-8 weeks old were selected and randomly divided into 9 groups according to the random number table,10 mice per group.The group A was injected by phosphate buffer solution(PBS);the group B was intraperitoneally injected by LTA;the group C was intraperitoneally injected by LTA + ERK inhibition agent;the group D was intraperitoneally injected by LTA + JNK inhibitor;the group E was intraperitoneally injected by LTA + p38 inhibitors;the group F was intraperitoneally injected by LTA + ERK and JNK inhibitor;the group G was intraperitoneally injected by LTA + ERK and P38 inhibitor;the group H was intraperitoneally injected by LTA + JNK and P38 inhibitors;the group I was intraperitoneally injected by LTA + three kinds of inhibitors.9 groups were injected for 5 d,once a day.After 7 d feeding,the mice all were sacrificed.The phosphorylation levels of ERK1/2,p38MAPK and JNK protein in the peritoneal macrophages MAPK family were detected by using immunoblotting (Western blot).Results (1) The ERK1/2 protein phosphorylation levels of abdominal cavity macrophage in the group B was significantly increased compared with the group A,the difference was statistically significant (P<0.05);the abdominal cavity macrophage p38MAPK and JNK average fluorescence intensity had no statistical difference between these two groups (P>0.05);(2) In the other 7 groups,the corresponding protein expression levels were almost zero,moreover had no effect on the expression of other proteins.Conclusion LTA is probably to activate the macrophages to express,synthesize and secrete cytokines by activating ERK1/2 in macrophages MAPK family,inhibitor can effectively block the protein expression pathway without affecting the expression of other proteins.

bifidobacterium; lipoteichoic acid; macrophages; mitogen activated protein kinase

广东省深圳市科技计划项目(201202125)。

李迎雪,女,硕士研究生,主治医师,研究方向为胃肠病学。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.13.002

A

1672-9455(2015)13-1821-03

2015-01-20

2015-03-10)

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