姜曲海猪FoxO1基因遗传多态性及与肉质性状的相关分析

朱淑斌， 周春宝， 韩大勇， 倪黎纲，2， 陶 勇， 赵旭庭， 王平安

(1.江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300;2.姜曲海猪保种场，江苏 泰州 225300)

随着生活水平的不断提高，人们对畜产品品质的要求也不断提高。猪肉作为人膳食中的重要组成部分，其质量更是人们一直关注的重点，高蛋白、低脂肪、低胆固醇、鲜嫩多汁的鲜猪肉在市场最受消费者欢迎。

FoxO转录因子是Fox家族的亚家族成员，在哺乳动物中主要有 FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6，每种蛋白质均高度保守［1］。FoxO转录因子具有广泛的生物学效应，对机体的多个组织，如肌肉组织、脂肪组织和肝脏等都起着重要调控作用［2-3］。猪的FoxO1基因定位于11号染色体，含有2个外显子和1个内含子。王玲研究发现牛FoxO1基因单倍型组合与肌内脂肪含量、剪切力、肌纤维直径和肌纤维密度存在不同程度的相关性［4］。

本研究利用PCR-RFLP方法对地方猪种姜曲海猪的FoxO1基因多态型以及FoxO1基因对猪肉质性状的遗传效应进行分析，旨在寻找与姜曲海猪肉质性状相关的遗传标记，为提高肉质的研究工作探寻更为简便有效的方法，并进一步为姜曲海猪地方猪种种质资源特性及标记辅助选择(MAS)研究提供分子生物学参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

取112头姜曲海猪耳样组织(均来自姜曲海猪保种场)，用耳号钳剪一小块耳组织(约0.5 g)，放入盛有1 ml 70%乙醇的1.5 ml Eppendorf管中，样品于－20℃保存。选取含有不同组合基因型的试验猪进行屠宰，于右半胴体背最长肌中段最后肋与第一、二腰椎间中心部位取样，测定肉质性状。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 参照文献［5］按常规方法提取基因组DNA，将干燥后的DNA溶于100μl TE中，并用1.5%的琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的质量。1.2.2 PCR扩增 参照 GenBank中 FoxO1基因(NM_214014.2)序列，设计引物 P1(5'-TGTCATTATGGGGAGGAGAGT-3')、P2(5'-GAGATAAGCAATCCTGAGAAC-3')，PCR产物大小为 337 bp。引物由上海生工公司合成。PCR扩增体系(50.0 μl):5× Goldstar PCR buffer 10.0 μl，Goldstar Taq polymerase 2.5 μl，dNTP(2.5 mmol/L)5.0 μl，上、下引物各 2.5μl，模板 DNA 5.0μl，灭菌蒸馏水22.5μl。PCR扩增条件:预变性95℃ 10 min;变性95 ℃ 30 s，退火59℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，共35个循环;最后72℃延伸7 min;4℃保存。

1.2.3 PCR扩增产物的酶切 用Bpil酶切337 bp扩增产物，酶切体系20.0μl，其中，PCR扩增产物5.0 μl，10 ×Buffer 2.0 μl，限制性内切酶 0.5 μl，灭菌蒸馏水12.5μl。37℃反应1 h 45 min，95℃ 10 min，酶切产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.4 肉质性状的测定 肉色、大理石纹、pH值、系水力和剪切力测定方法参照文献［6］，肌内脂肪含量测定参照文献［7］，采用索氏抽提法提取肌内脂肪。

1.3 统计分析

1.3.1 基因频率和基因型频率的计算 计算公式为:Pi=［2(ii)+(ij1)+(ij2)+… +(ijn-1)+(ijn)］/2n，式中，Pi为第 i个等位基因的频率，i为纯合的复等位基因，ii为第i个等位基因纯合的个体数，jn为与i共显性的第n个等位基因，ijn为含有i与jn共显性等位基因的个体数，n为一个群体内个体的总数，j1、j2…jn为与i共显性的第1到第n个等位基因。由于PCR-RFLP方法的检测结果为共显性等位基因，因此表型频率即为基因型频率。基因型频率=基因型个体数/测定群体总数。

1.3.2 基因频率和基因型频率的差异显著性检验(χ2独立性检验) 首先根据基因频率计算各种基因型频率的理论值，然后计算χ2。由于本研究资料的自由度df=1，某些基因型理论值小于5，因此采用矫正公式，式中，Ti为理论值，Ai为实际观察值，n为等位基因数。

1.3.3 FoxO1转录因子的纯合度、杂合度、有效等位基因数的计算 纯合度计算公式为式中，H0为某一位点的纯合度，Pi为第i个等位基因的频率，n为某一位点的等位基因数。杂合度计算公式为为某一位点的杂合度，Pi为某一位点上第i个等位基因频率，n为某一位点的等位基因数。有效等位基因数计算公式为

1.3.4 FoxO1转录因子多态信息含量的计算 多态信息含量(PIC)是由Bostein等提出的用于度量群体多态程度的指标，一个标记在群体中的PIC值是根据其等位基因的频率来计算的。其公式为:PIC=1－，式中，n为等位基因数目，P和iPj分别为第i和第j个等位基因在群体中的频率。PIC值用于对标记基因多态性的估计，PIC＞0.50为高度多态，PIC＜0.25为低度多态，0.25≤PIC≤0.50为中度多态。

1.3.5 FoxO1转录因子对肌内脂肪(IMF)含量的效应分析模型 采用固定模型:Yijklm=μ+Ai+Bj+Ck+Dl+Rm+eijklm。式中，Yijklm为IMF含量测量值，μ为群体均值，Ai为场效应，Bj为品种效应，Ck为年龄效应，Dl为性别效应，Rm为基因型效应，eijklm为随机残差效应［8］。由于选择的试验群体来自同一猪场的同一品种，屠宰年龄接近，所以去掉场效应、年龄效应和品种效应，以上固定模型简化为Y=μ+Dl+Rm+elm。采用 SPSS13.0软件包的 GLM(General linear model)过程分析不同FoxO1转录因子不同基因型对肉质性状的影响。

2 结果

2.1 姜曲海猪FoxO1基因PCR扩增产物的电泳结果

PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果(图1)显示，扩增片段(337 bp)与目的片段大小一致，且特异性较好，可直接进行PCR-RFLP。

图1 FoxO1基因337 bp的PCR产物Fig.1 PCR product of FoxO1 gene

2.2 FoxO1基因的RFLP结果

酶切产物中出现3种带型，酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图谱见图2。将此酶切位点不存在时产生的酶切片段类型定义为等位基因E(337 bp)，存在时产生的酶切片段类型定义为等位基因e(245+92 bp)。

图2 Bpil酶切337 bp PCR产物的琼脂凝胶电泳图谱Fig.2 Agarose gel image of PCR product of FoxO1 digested with Bpil

2.3 试验猪群的Hardy-Weinberg平衡状态检验

χ2适合性检验结果显示 χ2值为 4.07，小于5.99，表明该群体基因频率和基因型频率都处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05)，主要原因可能是由于该群体在适应性方面具有遗传优势，为长期自然和人工选择所致。

2.4 FoxO1基因Bpil位点的基因型、基因频率及遗传多态性分析

利用PCR-Bpil-RFLP检测了姜曲海猪猪群的基因频率并分析了其遗传多态性。结果显示:FoxO1基因各基因型在姜曲海猪群中都有分布，在112头姜曲海猪中有81头为EE型，25头为Ee型，6头为ee型;基因(E)频率为0.834 8;Bpil位点杂合度(He)为0.275 8，有效等位基因数(Ne)为1.380 8;姜曲海猪多态信息含量(PIC)为0.237 8，属低度多态(PIC ＜0.25)。

2.5 姜曲海猪FoxO1基因不同酶切基因型对肉质性状的影响

利用SPSS软件对不同基因型姜曲海猪肉质性状数据进行统计分析，结果(表1)表明FoxO1基因Bpil位点3种基因型对姜曲海猪的大理石纹、剪切力和肌内脂肪含量均有不同程度影响。EE型和Ee型姜曲海猪大理石纹和肌内脂肪含量均显著高于ee型(P＜0.05)，EE型和Ee型之间差异均不显著(P＞0.05);EE型剪切力显著低于Ee型和ee型(P＜0.05);肉色、pH值和失水率基因型间无显著差异。

表1 姜曲海猪FoxO1基因PCR-Bpil-RFLP的3种基因型肉质性状比较Table 1 Comparison of meat quality among three genotypes of FoxO1 gene in Jiangquhai swine

3 讨论

猪种基因遗传多态性丰富程度与该品种的遗传基础有着紧密的联系，品种的遗传基础越广泛，其DNA多态性就越丰富。本研究中，首次检测了地方品种姜曲海猪FoxO1基因的多态性。从NCBI中可以知道猪的FoxO1基因定位于11号染色体，含有2个外显子和1个内含子，内含子片段很长，目前FoxO1基因多态性研究多集中在人和小鼠方面。Lunetta等采用全基因组关联分析发现在弗明汉人群中FoxO1基因有2个 SNP(单核苷酸多态)［5］。唐媛等研究了中国北方汉族人群FoxO1基因的多态性［6］。在家畜方面FoxO1基因多态性的研究很少，王玲等通过测序技术检测到FoxO1在肉牛群体中分别存在8个多态性位点［4］。

本试验利用PCR-RFLP检测了姜曲海猪FoxO1基因多态性，先将肉质差异较大的样品进行克隆测序，初步筛选SNP位点，根据位点的实际情况，再选用适宜方法检测SNP。结果表明FoxO1基因第1外显子1 404 bp存在SNP，姜曲海猪FoxO1基因出现了全面的多态性，基因的各种基因型频率和基因频率的χ2检验结果显示，χ2值均小于5.99，表明该群体基因频率和基因型频率都处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05)。姜曲海猪FoxO1基因多态信息含量为0.237 8，属低度多态。一般认为，多态性越高的群体，其遗传多样性越丰富。由此可知，姜曲海猪的FoxO1基因遗传多样性低，这可能与群体本身的遗传结构和近年保种有关。群体的遗传结构受群体大小、交配系统、祖先群体的多态性以及迁移、突变和选择等许多因素的影响。

目前，FoxO基因多态性与性状的关联分析报道主要集中在人类医学研究方面。唐媛等研究了中国北方汉族人群FoxO1基因的多态性与2型糖尿病易感性的关联性［6］。Lunetta等报道在弗明汉人群中FoxO1基因的2个SNP与死亡年龄显著相关［5］。黄宁等报道FoxO1基因与肿瘤、糖尿病及代谢疾病密切相关［7］。由此可见，FoxO转录因子功能极其广泛，主要是由于FoxO转录因子能够调节PI3K/AKT或PI3K/PKB信号通路中的下游基因，而这些基因与细胞生理过程相关，如细胞凋亡、DNA损伤/修复、应激等，此外FoxO转录因子在脂肪分化、肌肉生成等过程中也发挥着关键作用。张辉等以C2C12成肌细胞为模型，研究发现过表达FoxO1能诱导Ⅰ型肌纤维向Ⅱ型肌纤维转化，并显著降低钙调磷酸酶活力［8］。由此我们推断猪FoxO基因可能也影响猪的多方面机能。

本试验研究了猪FoxO1基因遗传多态性与肉质性状的相关性，发现姜曲海猪FoxO1基因不同基因型间大理石纹、剪切力和肌内脂肪含量均有不同程度差异。FoxO1基因PCR-Bpil-RFLP的3种基因型中，EE型和Ee型的大理石纹和肌内脂肪含量显著高于ee型，这可能与FoxO1基因间接参与脂肪代谢有关。张野等采用实时荧光定量PCR技术，对不同月龄民猪和长白猪肾周脂肪中FoxO1、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)和CAAT区/增强子结合蛋白α(C/EBPα)基因 mRNA表达量进行检测，结果表明FoxO1基因可能通过抑制PPARγ和C/EBPα这2个基因的表达来减少脂肪沉积［9］。史新娥等报道FoxO1转录因子去磷酸化可以抑制猪前体脂肪细胞分化［10］。

鉴于猪FoxO1基因遗传多态性与肉质性状存在相关性，可以推断，在骨骼肌生长发育中，FoxO扮演了重要角色。其主要原因是由于FoxO转录因子广泛参与生理代谢［11］。祁样正报道FoxO基因表达量会随着肌肉生长分化有所增长，而FoxO1在肌肉分化过程中，表达量一直保持较高，而且变化不明显，这可能与其重要的功能有关［12］。杨燕军等报道FoxO1与Ⅰ型和Ⅱb型肌纤维基因的表达密切相关[13]。

在本研究中，由于试验条件的限制，样本数目有限，这在一定程度上影响了遗传效应分析的准确性。在今后的研究中应扩大样本含量，在更多的群体中进行分析，以深入研究FoxO家族基因对肌肉和脂肪性状所起的作用，找到有效的分子标记应用于标记辅助选择育种。

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