两种方法检测血红蛋白H百分比一致性比较*

王阿慧，凌艳英，庄秋容，邓家德

(广东省广州市第一人民医院检验科 510180)



·临床研究·

两种方法检测血红蛋白H百分比一致性比较*

王阿慧，凌艳英，庄秋容，邓家德

(广东省广州市第一人民医院检验科 510180)

目的 比较高效液相色谱方法(HPLC)和醋酸纤维素薄膜碱性电泳(CAFE)方法对血红蛋白(Hb)H定量的一致性。方法 采用HPLC和CAFE对广州市第一人民医院已行基因确诊的50例缺失型Hb H病患者标本进行检测，详细记录和分析其相关血液学指标。结果 缺失型HbH病患者经HPLC检测可出现特异HbH异常峰，出峰时间为(0.42±0.05)s,CAFE可得到特异的HbH带。两种方法得到的HbH百分比经配对t检验差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HPLC是一种高效快速检测HbH的方法，是能满足临床快速检测缺失型HbH病的有效手段。

缺失型血红蛋白H病； 高效液相色谱方法； 醋酸纤维素薄膜碱性电泳

海洋性珠蛋白生成障碍性贫血是我国华南地区常见的以慢性进行性溶血为特点的一组遗传病。根据临床表现的严重程度，α珠蛋白生成障碍性贫血可分为静止型、轻型、中间型和重型。血红蛋白(Hb)H病属于α珠蛋白生成障碍性贫血的中间型,由于4个α基因中有3个缺失或缺陷，α链严重合成不足，相对过剩的β链自行聚合为4聚体即HbH。HbH性质不稳定，易形成包涵体沉积在红细胞内，使红细胞在通过脾脏时易于被破坏，出现贫血等症状[1]。由于珠蛋白生成障碍性贫血除干细胞移植外，尚无有效治疗手段，因此采用相应技术方法，筛查出高风险夫妇，并采取孕期产前诊断以阻止重症患儿出生，是国内外公认的首选预防措施[2]。缺失型HbH病在外周血中可检测出HbH。传统的检测HbH的常用方法有醋酸纤维素膜碱性电泳(CAFE)、Hb电泳、包涵体试验等。本试验中采用碱性CAFE及高效液相色谱方法(HPLC)检测HbH百分比，以比较二者之间的一致性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 全部病例为2012～2013年在广州市第一人民医院诊治的患者，经基因检测为α珠蛋白生成障碍性贫血缺失型HbH病50例。抽取患者4 mL肝素锂抗凝血备用。

1.2 仪器与试剂 美国Bio-Rad公司Variant Ⅱ Hb HPLC分析系统及配套β-thalassemia试剂；北京市六一仪器厂生产的DYY-2C型电泳仪及电泳槽。其他试剂为一般分析纯。

1.3 Hb HPLC分析 取肝素锂抗凝全血4 mL,无需制备溶血液直接进行高效液相色谱分析。按仪器说明书操作，Hb各成分定量约7 min后由HPLC分析仪自动分析计算。

1.4 CAFE HbH定量肝素锂抗凝血，用四氯化碳抽提制备Hb液，取20 μL加样于已浸透Tris缓冲液的醋酸纤维素薄膜上，置于pH8.6的硼酸缓冲液中电泳约30 min，分别剪取HbA2、HbA、HbH，加蒸馏水浸泡，待Hb完全洗脱后，用723分光光度计以415 nm波长比色，计算HbH百分比。

1.5 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行分析，两种方法得到的HbH百分比比较采用配对t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 分离HbH条带 将抗凝血球用生理盐水洗涤，四氯化碳萃取Hb液,以20 μL量点样于醋酸纤维素薄膜上，经pH8.6的碱性缓冲液电泳可获得HbH条带。图1示自负极向正极泳动条带依次为HbA2(HbH患者标本中HbA2降低显著，电泳时HbA2带隐约可见)、HbA、HbH。将条带依次剪下，洗脱于相应体积蒸馏水中并用723分光光度计以415 nm波长处比色，经计算即可获得HbH占Hb的百分含量，计算公式为：HbH(%)=2×AHbH/(5×AHbA+2×AHbH+AHbA2)%。

图1 Hb经CAFE分离出HbH条带(pH 8.6)

2.2 HPLC检测HbH 取肝素锂抗凝全血4 mL，无需前处理直接上样于Variant Ⅱ HPLC分析仪，约7 min后得到分析图谱，相应出峰时间范围可见一明显的异常洗脱峰，见图2、3。在设置中将START TIME由0.55 s改为0.00 s,显示按出峰时间(0.42±0.05)s对应异常峰的峰面积即是HbH百分比。

图2 HPLC检测HbH可见HbH异常峰

图3 HbH患者HPLC图分析结果

2.3 两种方法检出HbH百分比的一致性比较 CAFE测得HbH百分比为(7．96±3．01)%，HPLC为(8．06±3．04)%。两种方法测得的HbH百分比采用配对t检验,其差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

临床上筛查常用检测Hb的方法有Hb电泳、红细胞指数、红细胞脆性试验等。这些方法虽操作要求低，成本低廉，但又因其敏感性和特异性较低，人为影响因素较大，存在较多漏诊和误诊现象。目前临床上对珠蛋白生成障碍性贫血的诊断和鉴别主要依靠Hb分析，该方法所用标本无需前处理，容易操作，并进行质控，准确性和重复性也比较好[3]。

近年来发展起来的基于阳离子交换的HPLC是以物理化学原理为主的分离分析方法，特别适合于生物大分子，如各种蛋白组分的分离，已实现高通量全自动化分析，操作简单，人为因素影响少。在分离的同时，根据出峰位置可以定性；根据峰面积可以定量，选择性、灵敏度、准确性高，适合目前珠蛋白生成障碍性贫血大规模筛查与常规诊断[4]。HPLC已成为目前对于珠蛋白生成障碍性贫血非基因检测手段中最经典的方法，广泛应用于临床。尤其在对于β-珠蛋白生成障碍性贫血的检测，HPLC是介于筛查和确诊之间的一种理想方法，已被国际珠蛋白生成障碍性贫血协会推荐为β-珠蛋白生成障碍性贫血的常规筛查方法[5]。

Variant Ⅱ β-thalassemia Short program HPLC分析系统专用于检测β-珠蛋白生成障碍性贫血且可同时检测各种异常Hb。尽管对于α-珠蛋白生成障碍性贫血的检测存在一定的漏检，但是对于缺失型HbH病患者，异常HbH的检出还是有优势的[6]。本文比较应用CAFE和HPLC Hb分析仪在定量HbH方面是否存在一致性，以本院已行基因确诊的50例缺失型HbH病患者标本进行检测，经HPLC检测出现异常峰标本，CAFE均能发现HbH带。有研究显示，CAFE对于HbH的分离能力要优于琼脂糖凝胶电泳，可清楚地分离出HbH带及HbBart′s带[7-8]。但是作为手工法，CAFE存在很多不足，分辨率较差仅能分辨出HbH、HbBartS、HbA、HbA2条带，操作较繁琐费时且影响因素多，重复性差。醋酸纤维素薄膜脆而易碎，区带颜色易掉，不易保存。而HPLC可快速高效地分离出Hb各组分，重复性高[9]。本次研究使用的全自动Hb分析仪采用HPLC对人Hb、HbA2及HbF进行自动化定量测定，可将珠蛋白生成障碍性贫血初步分类为α珠蛋白生成障碍性贫血和β珠蛋白生成障碍性贫血，同时还可检出HbH、HbS、HbE、HbQ、HbJ等异常Hb，具有高效快速，自动化程序高，准确性和重复性良好等优点，是介于筛查和确诊的试验。

但在实践工作中，必须根据特定仪器及配套试剂的适应范围，总结经验，并结合受检者家族史，血液学表型红细胞指数等其他实验室检查结果，进行综合分析，以避免误诊和漏检。

[1]邓家栋，扬崇礼，扬天楹，等．临床血液学[M]．上海：上海科学技术出版社，1985：623-624．

[2]Chen FE,Ooi C,Ha SY,et al.Genetic and clinical features of hemoglobin H disease in Chinese patients[J].N Engl J Med,2000,343(8):544-550.

[3]马升俊，肖永君，韦子斌，等．全自动血红蛋白分析仪在地中海贫血筛查诊断中的应用[J]．中国医药导报，2013，10(9)：92-93．

[4]Colah RB,Surve R,Sawant P,et al.HPLC studies in hemoglobinopathies[J].Indian J Pediatrics,2007,74(7):657-662.

[5]郑琳，黄海龙，范向群，等．高效液相色谱技术检测β-地中海贫血的临床价值探讨[J]．中国妇幼保健，2011，26(11)：1665-1666．

[6]彭建宏，刘运科，肖春燕．离子交换高效液相色谱法血红蛋白分析筛查地中海贫血的研究[J]．国际医药卫生导报，2012，18(4)：539-543．

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[8]陈永秀，周云珍，陈锦宏，等．两种电泳方法血红蛋白分析一致性的比较[J]．检验医学，2013，28(3)：229-232．

[9]谢建红，张永良，肖奇志，等．应用高效液相色谱法检测β-地中海贫血及异常血红蛋白[J]．广东医学，2011，32(11)：1473-1476．

医学统计工作的基本内容

按工作性质及其先后顺序，可将医学统计工作分为实验设计、收集资料、整理资料、分析资料。实验设计是开展某项医学研究工作的关键，包括医学专业设计和统计学设计，医学专业设计的内容包括研究对象纳入和排除标准、样本含量、获取样本的方法、分组原则、观察(检测)指标、统计方法等。收集资料的方法包括各种试验、检测或调查，要求资料完整、准确、及时、有足够数量、具有代表性和可比性等。整理资料包括原始资料的检查与核对、对资料进行分组与汇总等。分析资料即对资料进行统计学分析，包括进行统计描述和统计推断。

广东省广州市医药卫生科技项目(20131A011013)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.03.040

A

1672-9455(2015)03-0385-02

2014-08-07

2014-10-28)