衣壳蛋白和甲基转移酶对戊型肝炎病毒的基因分型

胡玲玲，王跃荣(上海中医药大学附属市中医医院检验科，上海 200071)



衣壳蛋白和甲基转移酶对戊型肝炎病毒的基因分型

胡玲玲，王跃荣△(上海中医药大学附属市中医医院检验科，上海 200071)

目的 探讨人戊型肝炎病毒(HEV)的部分编码区序列能否作为其基因组分型的依据。方法 从GenBank中查找并下载全基因组测序完整的能感染人类的HEV基因组及蛋白序列共35株，用Clustal W程序对35株HEV全序列以及部分编码区序列进行多序列比对，并用treev 32绘制基因进化树，研究其进化关系。结果 HEV的基因组全长7.5 kb；而衣壳蛋白和甲基转移酶的编码序列分别为1 982 bp和545 bp，这2种蛋白的多序列比对和进化分析结果与完整基因组的分型结果相符。结论 衣壳蛋白和甲基转移酶可作为HEV的分型依据，且是一种更简便、快捷的方法。

戊型肝炎病毒； 基因型； 衣壳蛋白； 甲基转移酶

戊型肝炎病毒(HEV)引起的戊型肝炎是一种经粪-口途径传播的传染病，是发展中国家重要的公共卫生问题之一[1-2]。孕妇患病率较高，且病情严重，常出现流产、死胎或急性肝坏死[3]。HEV是单股正链RNA病毒，有3个开放读码框(ORF)[4]。ORF1主要编码5种非结构蛋白：甲基转移酶、木瓜样半胱氨酸蛋白酶、多聚脯氨酸铰链、解旋酶和RNA依赖的RNA聚合酶；ORF2为病毒的主要结构蛋白编码区，主要编码衣壳蛋白。

戊型肝炎的诊断和疫苗的研制均涉及HEV分型，有报道显示戊型肝炎发病的严重性及预后与HEV基因类型相关。目前能感染人类的HEV分为4个基因型，主要是根据各HEV分离株全基因序列的核苷酸同源性，由于采用了全部的基因信息，因此结果最为准确[5]。但全基因测序费时费力，且序列较长，比对较困难，甚至无法进行，所以多数研究人员致力于设计出更为简便和有效的分型方法。国内外研究者大多选取HEV部分基因序列替代全基因序列进行基因分型。本研究选取HEV部分基因序列探讨能否替代全基因序列进行基因分型，报道如下。

1 资料与方法

1.1 HEV参考株 Chi-XJ1株(NC_001434)为基因型4型，是GenBank中测序最全且准确的。基因2型只有墨西哥分离株(MEX-14)的全基因序列收录在GenBank中，在此不列入研究，主要对基因1、3、4型进行探讨。

1.2 多序列比对和系统进化分析 多序列比对是序列分析的基础，有时用来区分1组序列之间的差异,但其主要用于描述1组序列之间的相似性关系，生成系统树图，将序列按相似性分组。目前使用最广泛的多序列比对程序是Clustal W。本组使用Clustal W程序对35株HEV全序列进行多序列比对，用treev 32绘制基因进化树，研究其进化关系。

1.3 核苷酸序列比对和系统进化分析 从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的GenBank中查找并下载全基因组测序完整的、能感染人HEV基因组及蛋白序列共35株，其中1型有12株，3型有9株，4型有14株。利用Clustal W和 treev 32软件对HEV的全基因组以及HEV编码的蛋白质基因片段分别进行多序列比对，进行基因进化树和同源性分析。

2 结 果

2.1 35株HEV的全基因组多序列比对结果 将测序完整的35株HEV基因组用Clustal W进行多序列比对，treev 32进行进化树分析。如不考虑测序误差，图1显示全基因序列的多序列比对将35株HEV分成3个基因型，每株病毒的分型结果都与GenBank一致。基因1型的HEV集中在右下支，基因3型集中在左下支，而基因4型集中在上支，提示HEV全基因组的多序列比对及进化树分析可用于基因分型。见图1。

2.2 衣壳蛋白的基因序列对HEV的基因分型 本组从GenBank中查找的35株人HEV几乎都有其编码的核衣壳蛋白序列(除D、Chi-HB)。将编码这些衣壳蛋白的基因序列用Clustal W进行比对，并用treev 32进行进化分析。图2和图1进行比较，提示编码HEV病毒衣壳蛋白的基因序列和全基因序列的多序列比对，在HEV的分型取得了一致的结果，同时也将35株HEV分成了3个基因型，且每株病毒都被正确地归类到该基因型中。但比对的基因序列长度，前者只有2 kb左右，而后者却有7.5 kb，极大地节约了测序成本，也减少了操作时间，表明HEV的衣壳蛋白的基因序列也可作为HEV的分型依据。见图2。

图1 35株HEV全基因组进化树

图2 33株HEV衣壳蛋白基因序列进化树

图3 35株HEV甲基转移酶基因序列进化树

2.3 甲基转移酶的基因序列可用于HEV的基因分型 甲基转移酶是HEV的非结构蛋白之一，与病毒RNA复制相关，长度仅为545 bp。本组用同样的方法将甲基转移酶的基因序列也进行多序列比对和系统进化树分析，显示编码HEV病毒甲基转移酶的基因序列和全基因序列的多序列比对在HEV的分型也取得了一致结果，均将35株HEV准确地分成了3个基因型，虽然各个基因型内部的进化树有所不同，但每株病毒都被正确地归类到该基因型中，所以可以把甲基转移酶也作为HEV的分型依据。见图3。

3 讨 论

我国是戊型肝炎的主要流行区之一，自20世纪50年代被首次报道以来，由于实验室检测技术的局限，其发病率和感染率一直被低估。近几年来，戊型肝炎患者例数逐渐上升，严重危害人们的健康，降低其生活和工作质量，因此对HEV的研究尤其重要[6-7]。

免疫学诊断是目前我国临床戊型肝炎诊断的主要手段，用HEV重组抗原检测HEV抗体是主要方法之一，但受包被抗原的特异性和敏感性限制；也可同时进行HEV RNA的PCR检测，但不同HEV基因型常对引物有一定的选择性，不易找到具有普遍、通用性的高灵敏引物，目前应用较多的是HEV ORF2区域内150 nt片段。

戊型肝炎发病的严重性还受到HEV基因类型的影响，虽然其一直被认为是急性自限性疾病，一般无慢性病患者。但已有的研究却发现一些服用免疫抑制剂的器官移植患者、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者等出现慢性HEV感染，并被确诊为基因3型HEV感染[8-11]。而HEV的持续感染在基因1、2型感染者还未见报道。也有研究显示感染HEV基因4型感染患者比3型患者发病更严重[12]。因此，为了可以更好地判断戊型肝炎的病情及预后，需快速、准确地对HEV进行基因分型。

传统的HEV分型是基于全基因序列的比对分析，虽然准确性较高，一旦序列比较长，待比较的序列数目较多时，比对时间延长，甚至无法进行，改进的方法是可以选取全序列的某一片段来替代全基因组序列进行比对。本研究从GenBank中下载35株测序完整的、能感染人类的HEV基因组及蛋白序列，其中1型有12株，3型有9株，4型有14株(由于基因2型只有墨西哥分离株MEX-14的全基因序列收录在GenBank中，在此没有列入研究)。

本组对35株HEV的衣壳蛋白和甲基转移酶分别用Clustal W进行多序列比对，并用treev 32绘制进化树，描述各病毒株之间的亲缘关系，发现结果与全基因序列的比对结果一致，皆可分为1、3、4型，虽然各型内的进化关系稍有不同，但基因型的分类与GenBank中的报道一致。HEV基因组全长为7.5 kb，与其相比，本组选取的片段具有更大的优势，其中衣壳蛋白编码序列为1 982 bp，甲基转移酶仅为545 bp。

综上所述，通过本研究发现，对HEV进行基因分型，可以不对病毒全部基因组序列进行测序，只需设计合适的引物扩增出衣壳蛋白或甲基转移酶，并将PCR产物测序作进化树分析即可，从而为HEV的分型找到了一种更简便、更快速的方法。当然这只是从生物信息学的角度探讨HEV的初步分型，至于临床的具体应用还有待于进一步的探讨和研究。

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Capsid protein and methyltransferase can be used for genotyping of hepatitis E virus

HULing-ling,WANGYue-rong△

(DepartmentofLaboratoryMedicine,ShanghaiMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoShanghaiTCMUniversity,Shanghai200071,China)

Objective To understand the part of the coding region can be used as the basis for the genotyping of hepatitis E virus(HEV).Methods Thirty-five full-length sequences of HEV currently available in GenBank were download,and sequence alignment and evolutionary analysis of these thirty-five full-length sequences and part of the coding region were done.Results The complete genome of HEV was 7.5 kb in length，while Capsid Protein was 1 982 bp,Methyltransferase was 545 bp.The result of sequence alignment and evolutionary analysis of the two kinds of protein were consistent with the complete genome of HEV.Conclusion The sequence of Capsid Protein and Methyltransferase is shorter,and can be used as the basis for the genotyping of HEV,which is more simple and rapid.

hepatitis E virus; genotype; capsid protein; methyltransferase

胡玲玲，女，硕士，检验师，主要从事生物化学与分子生物学的研究。

△通讯作者，E-mail：wangyuerong1213@sina.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.11.020

A

1672-9455(2015)11-1545-02

2014-12-25

2015-02-18)