黄芪总黄酮抑制肝硬化大鼠肝组织脂肪酸转位酶和环氧化酶2表达*

麦静愔，汪美凤，候天禄，平 键，陈高峰，成 扬

黄芪总黄酮（Total flavonoids of astragalus，TFA）是从黄芪中分离的主要活性成分，具有保肝、免疫调节、抗氧化、抗细胞凋亡、抗病毒和抗肿瘤等多种生物学作用[1]。肝硬化是在肝炎病毒、酒精、血吸虫、工业毒物、药物等致病因子的有害刺激作用下，发生肝细胞损伤、弥漫性变性坏死、肝细胞结节状再生，肝脏呈进行性、弥漫性纤维病变，纤维结缔组织增生、分割包绕形成假小叶，肝脏缩小、变硬，形成肝硬化，出现肝功能减退、门脉高压、腹水等表现。如何逆转肝硬化仍然是临床面临的难题[2]。本课题组前期研究发现TFA能够降低肝硬化大鼠肝组织羟脯氨酸水平，减轻肝窦狭窄，抑制假小叶形成，表明TFA具有较好的抗肝纤维化作用[3]。本研究采用二甲基亚硝胺（DMN）诱导经典的肝硬化大鼠模型，应用TFA干预，以观察肝硬化大鼠肝组织脂肪酸转位酶（Fatty acid translocase，FAT）和环氧化酶2（Cyclooxygenase 2）表达的变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药物与试剂 53只SPF级雄性SD大鼠，体质量（150±10）克，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，饲养于我校实验动物中心SPF实验室，普通饮食，自由饮水。TFA纯度为80%，由我校中药学院提供。DMN购自日本东京化成工业株式会社。TRIzol总RNA抽提试剂购自美国Invitrogen公司。cDNA合成试剂盒和PCR试剂盒均为加拿大Fermentas公司产品。PCR引物委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。SYBR Green EX Taq为德国Gierner公司产品。BCA试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所。抗环氧化酶2多克隆抗体和抗FAT单克隆抗体购自美国EPITOMICS公司。抗GAPDH抗体购自上海康成生物。Odyssey IRDye 680 conjugated山羊抗兔IgG、IRDye 800CW驴抗小鼠IgG、Odyssey Blocking Buffer均产自美国Li Cor公司。Nonidet P40产于美国SIGMA-ALDRICH公司，PMSF购自美国Fluka公司。完全性蛋白酶抑制剂混合物为德国Roche公司产品；40% Acrylamide/bis Solution[N，N’-Methylenbisacrylamid，Mix，Ratio 37.5:1（2.6%C）]和 Tween-20购自美国Bio-Rad公司。预染蛋白标准品产于加拿大Fermentas公司。硝酸纤维薄膜、甘氨酸、Tris、TEMED、EDTA、SDS为美国 Amresco产品。异丙醇、溴酚蓝购自上海试剂三厂。过硫酸铵、甲醇、浓盐酸均为分析纯，购自中国国药集团化学试剂有限公司。

1.2 大鼠肝硬化模型的制备 喂养大鼠1 w后，随机分为正常组10只和造模组43只。按照本研究组所建立的造模方法[3]，以0.5%DMN按2 ml.kg-1体质量腹腔注射，首次注射全剂量的2/3，1次/d，连续注射3 d后休息4 d。在实验第4 w，将DMN剂量更改为第1天全量，第2天减至2/3量，第3天减至1/2量。给予正常组大鼠等量的生理盐水腹腔注射。在实验的第3 w，造模组大鼠按体质量的轻重进行分层、随机分为造模组14只、小剂量TFA组14只、大剂量TFA组15只，分别给予 TFA 15 mg·kg-1和 30 mg·kg-1灌胃，共用药4 w。正常组和模型组用等剂量的蒸馏水灌胃，1次/d，共4 w。在实验结束时，大鼠禁食不禁水24 h，给予戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，取肝组织置于10%中性福尔马林液中固定，另一部分置于-80℃低温冰箱保存，待测。

1.3 肝组织胶原纤维检测 按照本研究组以前报道的方法[3]，取福尔马林固定的肝组织逐级酒精脱水，二甲苯透明，56℃石蜡包埋，4μm厚度切片，40℃水槽中展开，摊于玻片上，在烤片机上70℃烤片40 min，放入预先预热的湿盒中，滴加天狼猩红染液，置27℃染色25 min，无水乙醇分化，二甲苯分化，然后用中性树脂封片，在显微镜下观察。

1.4 肝组织环氧化酶2和FAT mRNA水平检测 采用Real-time PCR法，参照文献[4]，取肝组织，采用TRizol试剂进行RNA抽提，使用cDNA合成试剂盒逆转录为cDNA。采用特异性引物进行PCR扩增，使用的引物序列如下：环氧化酶2，上游5'GATCTACCCTCC CCACGTCCC3'，下游5'ACACTCTGTTGTGCTCCCGAA 3'，扩增片段长度119 bp；FAT，上游5'TT TGTTCTTCCAG CCAACGCCT3'，下游5'TTTGC ACTTGCCAATGTCCAGC，片段长度 126 bp；GAPDH，上游 5'CAAGTTCAACGGCACAGTCAAGG 3'，下游5'ACATACTCAGCACCAGCATCACC 3'，扩增片段116 bp。采用内参照GAPDH进行校正，计算目标mRNA水平。

1.5 肝组织环氧化酶2和FAT蛋白表达检测 采用Western blot法，参照文献[4]，使用RIPA裂解液分离肝组织总蛋白，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶中蛋白电转移至硝酸纤维素膜上，加Odyssey blocking buffer封闭，加入1抗（抗环氧化酶 2和抗 FAT，工作浓度，1:1000），4℃下摇床振荡过夜，洗涤后加入2抗反应。洗涤后将膜置于Odyssey仪器上扫描、分析，使用内参照GAPDH校正目标蛋白表达量。

1.6 统计学方法 应用SPSS 17.0软件，计量资料以（）表示，采用ANOVA程序进行单因素方差分析，并用LSD程序进行两两比较，以P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织胶原纤维的变化 在显微镜下观察发现，正常组大鼠肝脏仅在汇管区和中央静脉壁有少量胶原纤维沉积；与正常组比，模型组大鼠肝小叶结构消失，汇管区明显扩大，肝脏胶原纤维增生明显，纤维间隔形成，大量的纤维间隔向肝小叶伸展，部分包绕肝组织，形成假小叶；与模型组比，药物干预组大鼠胶原纤维增生程度明显减轻，其中以大剂量TFA处理组改善明显，完整的纤维间隔少见，部分间隔变得细长纤薄，汇管区扩大有所减轻，周围纤维组织也明显减少（图1）。

图1 各组大鼠肝组织学表现（天狼猩红染色，100×）

2.2 各组大鼠肝组织FAT mRNA及其蛋白表达水平的变化 检测显示，与正常组比，模型组肝组织FAT mRNA及其蛋白表达量显著上升（P<0.01）；与模型组比，小剂量和大剂量TFA组表达量显著下降（P<0.05或P<0.01），小剂量与大剂量TFA组比，也有显著差异（P<0.05，图 2、表 1）。

图2 各组大鼠肝组织FAT蛋白表达情况

表1 各组大鼠肝组织FAT mRNA及其蛋白水平（）变化

表1 各组大鼠肝组织FAT mRNA及其蛋白水平（）变化

与正常组比，①P＜0.01；与模型组比，②P＜0.05；③P＜0.01；与小剂量组比，④P＜0.05

只 FAT/GAPDH mRNA FAT/GAPDH蛋白正常组 10 0.16±0.06 0.14±0.046模型组 7 0.098±0.08① 1.05±0.076①小剂量 TFA 9 0.58±0.04② 0.67±0.021②大剂量 TFA 11 0.45±0.07③，④ 0.31±0.072③，④

2.3 各组大鼠肝组织环氧化酶2 mRNA及其蛋白表达水平的变化 与正常组比，模型组环氧化酶2 mRNA和蛋白表达量显著上升（P＜0.01）；与模型组比，小剂量和大剂量TFA组表达量显著下降（P＜0.05，P＜0.01），小剂量与大剂量TFA组比，也有显著性差异（P＜0.05，图 3、表 2）。

图3 各组大鼠肝组织环氧化酶2蛋白表达情况

表2 各组大鼠肝组织环氧化酶2 mRNA及其蛋白水平（）的变化

表2 各组大鼠肝组织环氧化酶2 mRNA及其蛋白水平（）的变化

与正常组比，①P＜0.01；与模型组比，②P＜0.05；③P＜0.01；与小剂量组比，④P＜0.05

环氧化酶2/GAPDH蛋白正常组 10 0.05±0.020 0.6±0.06模型组 7 0.78±0.044① 1.48±0.131小剂量 TFA 9 0.52±0.010② 1.24±0.11②大剂量 TFA 11 0.28±0.049③，④ 0.68±0.09③，④只环氧化酶2/GAPDHmRNA

3 讨论

肝纤维化是肝脏在各种致病原刺激下产生炎症反应，肝组织细胞外基质（Extracelluar matrix，ECM）过度增生与异常沉积，纤维组织增生，这种组织修复过程长期反复发展，形成肝纤维化，严重者肝脏结构被改建，假小叶形成，发展为肝硬化。肝纤维化是肝组织损伤和修复两个病理变化循环反复的动态过程，是多种慢性肝病发展为肝硬化的重要过程[4]。DMN诱导肝纤维化的机制是DMN代谢产物使核酸、蛋白质等重要的生命物质发生甲基化反应，诱发脂质过氧化损伤，肝细胞变性坏死，ECM进行性增加导致肝纤维化形成[3]。对肝硬化发病机制研究取得了许多进展，但是到目前为止，肝纤维化、肝硬化的治疗还是一大难点，国内外尚未研制出临床上有效的抗肝纤维化、肝硬化的生物或化学药物[2，5]。

黄芪对肝纤维化、肝硬化的治疗具有良好的效果[6]。TFA是黄芪提取物，含有清除自由基的主要活性成分，是发挥作用的主要成分[3]。有人研究发现TFA可预防扑热息痛诱导的小鼠肝损伤，增加血清超氧化物歧物酶活性，降低脂质过氧化产物活性[7]。本课题组前期研究则发现TFA能减轻肝硬化大鼠假小叶的形成，降低肝组织羟脯氨酸含量[3]。羟脯氨酸是一种非必需氨基酸，几乎所有的羟脯氨酸都存在于胶原中，因此羟脯氨酸含量已成为衡量机体胶原组织代谢的重要指标。胶原是肝纤维化时ECM的主要成分，故肝组织羟脯氨酸含量能客观地反映肝纤维化程度。本研究采用天狼星红染色结果发现TFA对肝组织的胶原增生有明显的抑制作用，表明TFA具有较好的抗肝纤维化作用。

FAT又称为 FAT/CD36、SCARB3、GP88、糖蛋白IV和糖蛋白IIIb，是一种细胞膜上的单链跨膜转运蛋白，具有发卡样的结构，由胞内区、跨膜区和胞外区三部分组成。属于 B类清道夫受体家族蛋白成员之一，是多种细胞、组织上表达的跨膜糖蛋白，属于B族清道夫受体。单核/巨噬细胞上的FAT是吞噬摄取氧化型低密度脂蛋白的主要受体，与动脉粥样硬化、糖代谢和胰岛素抵抗相关病变、脂肪肝、放射性肺损伤等多种疾病有关[8，9]。研究发现炎症因子可以促进脂肪酸负荷的HepG2细胞FAT/CD36的表达，并加重细胞内脂质积聚，从而加重肝细胞的损伤[9]。研究认为抑制FAT蛋白表达可以阻断TGF-β1的活化，可减少肺组织的胶原含量，防止胶原代谢失衡，对实验性矽肺纤维化具有一定的阻抑作用[10]。在正常情况下，细胞内环氧化酶2水平很低，主要分布于细胞核膜上。当受多种致炎因子和/或细胞因子诱导时，可大量产生环氧化酶2，存在于炎症部位，引起组织的炎症反应[11～14]。环氧化酶2可以促进新血管的生成，抑制环氧化酶2的表达，有望抑制慢性肝病发展为肝硬化，增加门静脉内淤滞的血液流出，从而降低门静脉压力。研究发现在CCl4诱导的肝硬化大鼠模型中，早期给予环氧化酶2抑制剂罗非昔布能有效改善肝窦毛细血管化，从而改善肝脏微循环障碍[15]。本研究发现TFA能够减少肝组织胶原增生，抑制肝组织FAT和环氧化酶2基因和蛋白表达，并呈现剂量相关性，表明TFA发挥抗肝纤维化作用与抑制FAT和环氧化酶2有关。

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